孙 湛， 马小娟， 姚雪萍， 于文燕， 马 琪△

(新疆医科大学基础医学院 1机能中心实验室， 2病理生理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830054)

黑木耳提取物对脓毒血症大鼠肝功能的保护作用*

孙 湛1， 马小娟2， 姚雪萍1， 于文燕2， 马 琪1△

(新疆医科大学基础医学院1机能中心实验室，2病理生理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的探讨黑木耳提取物对脓毒血症大鼠肝功能的保护作用及其机制。方法40只健康雄性Wistar大鼠，随机抽取10只为假手术组，其余大鼠使用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒血症动物模型，分为CLP组、黑木耳粗提物组及黑木耳多糖组，术前3 d分别给予预防性灌胃，造模12 h后，下腔静脉采血检测肝功能指标(ALT和AST)、内毒素(ET)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6，取肝标本做病理分析，免疫组织化学法观察肝组织NF-κB的表达。结果应用黑木耳粗提物及黑木耳多糖干预后，大鼠血清中ALT、AST、ET、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著低于CLP组(P<0.05)；肝组织病理改变减轻。CLP组肝细胞NF-κB强阳性表达，与对照组相比差异显著(P<0.05)；黑木耳粗提物组和黑木耳多糖组肝细胞NF-κB弱阳性表达。结论黑木耳粗提物及黑木耳多糖在有效降低脓毒血症大鼠血清ET的基础上，同时降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制脓毒血症大鼠肝组织细胞NF-κB的表达，对脓毒血症大鼠肝脏功能有保护作用。

黑木耳提取物； 脓毒血症； 肝功能； 全身炎症反应综合征

脓毒血症(sepsis)是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克和多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的发生，严重威胁患者生命。肝功能衰竭在各器官衰竭中发病率很高，肝细胞功能障碍又能诱发其它器官功能衰竭。因此，如何减轻脓毒血症造成的肝功能损伤成为治疗脓毒血症的重要部分。随着对脓毒血症发病机制和病理进程了解的不断深入，现认为脓毒血症的发病机制和造成的组织损伤是一系列细胞因子和炎症介质相互作用并作用于组织的结果[1]。

黑木耳是人们日常生活中的天然物质，且在我国资源丰富，是一种药食两用大型真菌。目前已发现黑木耳多糖(A.auricula-judaepolysaccharide)具有多种生物活性作用[2-4]，我们已经通过实验证实，黑木耳粗提物(A.auricula-judaecrude extract)能明显降低大鼠感染性休克过程血清中的内毒素含量，并对于感染性休克造成的心功能损害有保护作用，能有效保护心脏功能[5]。本研究拟通过盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒血症的急性肝损伤大鼠模型，探讨黑木耳粗提物和黑木耳多糖在脓毒血症大鼠模型中保护肝脏功能的作用，并探讨其机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级成年Wistar雄性大鼠40只，体重200～220 g，购于新疆医科大学实验动物中心。

1.2主要试剂及药品 内毒素检测试剂盒购自上海润成生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和IL-6 ELISA试剂盒、NF-κB p65免疫组化抗体购自北京永辉生物科技有限公司；显色基质鲎试剂盒上海榕柏生物技术有限公司；东北黑木耳购自青岛金海鸥水产有限公司，生产许可证号为QS370222010100。

2主要方法

2.1黑木耳粗提物和多糖的提取与纯化 采用黑木耳干子实体热水浸提法制备黑木耳提取物。称取一定量烤干至恒重的黑木耳样品，粉粹后加40倍水，90 ℃浸提3.5 h，重复抽提3次，蒸发浓缩，获得黑木耳粗提物。继续在上清液加入4倍体积的分析纯乙醇沉淀，沉淀即为黑木耳粗多糖。黑木耳粗多糖经Sevage 法反复脱蛋白、离心，减压浓缩、真空冷冻干燥后得到黑木耳多糖粉末，备用。

2.2脓毒血症大鼠模型制备及分组 雄性Wistar大鼠40只，称重后随机法分为假手术组、CLP组、CLP+黑木耳多糖组和CLP+黑木耳粗提物组，每组10只。术前灌胃3 d，假手术组和CLP组使用生理盐水灌胃，黑木耳多糖组和黑木耳粗提物组分别给予1%黑木耳多糖和1%黑木耳粗提物灌胃，每隔8 h灌胃1次，剂量为15 mL/kg体重。应用CLP法制备脓毒血症动物模型，手术区域5%碘酊消毒，75%乙醇脱碘2次，对照组大鼠开腹分离肠系膜翻动盲肠，不结扎穿刺，关腹；其余各组开腹分离肠系膜，找出盲肠结扎穿刺。

2.3标本采集 术后12 h，以20%乌拉坦1.5 g/kg的剂量腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清，-20 ℃保存。取肝脏，用滤纸吸干表面血液后，取部分组织固定于甲醛中用于石蜡切片。

2.4检测指标 用显色鲎试剂定量测定法测定血清内毒素含量。血清TNF-α、IL-1β、IL-6、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平分别采用相应的试剂盒严格按照试剂盒操作说明书进行测定。将石蜡包埋的肝组织制成4 μm厚的连续切片，用DAB法检测NF-κB的蛋白表达情况。以PBS代替Ⅰ抗进行免疫组织化学反应作为阴性对照。每张切片随机选取8个高倍视野，每组选取8张切片，经Olympus图像采集系统采集图像，利用Image-Pro Plus 5.1分析软件分析，每张切片于400倍镜下随机选取5个不同视野彩图，应用Meta Morph软件测定阳性细胞的积分吸光度(IA)。

3统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 17.0统计软件检查方差齐性，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1肝功能相关指标的变化

CLP组、黑木耳多糖组及黑木耳粗提物组大鼠血清ALT及AST水平均高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干预后，大鼠血清中ALT及AST水平明显低于CLP组(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Effects of different treatments on the serum levels of ALT and AST in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

图1不同处理对脓毒血症大鼠血清ALT及AST水平的影响

2各组大鼠肝组织病理变化

CLP组大鼠肝脏镜下可见肝细胞胞膜下有大量炎症细胞浸润，肝细胞呈片状水肿，大小不均匀，汇管区血管扩张充血，肝索排列已不清晰，胞核大小不规则；黑木耳多糖组及黑木耳粗提物组大鼠肝脏光镜下观察少量散在的炎症细胞浸润，肝细胞轻度肿胀，肝组织结构基本完整，见图2。

Figure 2. The pathological changes of liver tissues in different groups(HE staining, ×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

图2各组肝脏组织病理学改变

3各组大鼠血清内毒素的变化

与假手术组比较，CLP组、黑木耳多糖组及黑木耳粗提物组大鼠血清内毒素水平均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干预后，大鼠血清内毒素较CLP组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3. Effects of different treatments on the level of endotoxin(ET) in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

图3不同处理对脓毒血症大鼠血清内毒素水平的影响

4各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的变化

CLP组、黑木耳多糖组及黑木耳粗提物组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6较假手术组均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干预后，大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平明显低于CLP组， IL-6水平低于CLP组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

Figure 4. Effects of different treatments on the level of TNF-α, IL-1β and IL-6 in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

图4不同处理对脓毒血症大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影响

5肝组织NF-κB的表达

假手术组肝细胞中NF-κB较弱地表达；CLP组肝细胞NF-κB强阳性表达，与假手术组分别相比差异显著(P<0.01)；黑木耳粗提物组及黑木耳多糖组肝细胞NF-κB呈弱阳性表达，见图5、表1。

Figure 5. The expression of NF-κB in liver tissues (SP,×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

图5各组NF-κB在肝脏的表达情况

表1各组肝组织NF-κB的免疫组化图像分析结果

Table 1. The result of NF-κB expression in liver tissues detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=10)

GroupNF-κBexpressionControl16395.57±463.96CLP75508.08±756.36**A.auricula-judaepolysaccharide22724.59±984.97##A.auricula-judaecrudeextract21869.63±953.28##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCLP group.

讨 论

脓毒血症是严重创伤、烧伤及大手术后常见的并发症，临床上常常伴有MODS，是ICU患者主要死亡原因之一。脓毒血症急性肝损伤可发生在脓毒血症的任何阶段，脓毒血症发展为多脏器功能衰竭的标志之一是肝功能不全。脓毒症发病机制复杂，主要病理生理基础是以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放，某些介质对脓毒血症的产生和发展起十分重要的作用。本实验检测CLP组大鼠血清中内毒素水平高于假手术组，黑木耳粗提物组及黑木耳多糖组内毒素水平明显低于CLP组。CLP组反映肝功能的指标(AST和ALT)较假手术组也明显增高，黑木耳粗提物组及黑木耳多糖组AST和ALT水平均低于CLP组，差异有统计学意义。CLP组肝组织切片中显示有大量炎性细胞浸润，肝细胞呈片状水肿，大小不均匀。以上肝细胞的形态学改变也都提示肝细胞有严重的损害，表明CLP组大鼠肝脏严重损害；而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干预组，肝脏损伤较CLP组轻。

在炎症反应发生发展中，内毒素可直接刺激细胞分泌TNF-α，TNF-α起着始动作用，炎症反应过程中TNF-α是始动因素，IL-1β则起到协同作用。IL-1β主要存在于血液循环中，是具有多向性生物功能的炎症介质，能诱发机体代谢和血流动力学明显变化，促进炎症介质生成，导致炎性因子“瀑布效应”， IL-6具有强烈的中性粒细胞趋化作用和激活作用。NF-κB是多种促炎症基因高度转录的必需因子，可以促进与TNF-α等炎症因子有关的多种基因的转录，从而参与不同原因引起的组织损伤过程[6-7]。本研究中，CLP组、黑木耳多糖组及黑木耳粗提物组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6较假手术组均明显增高，差异有统计学意义，给予黑木耳多糖及黑木耳粗提物干预后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显低于CLP组。假手术组肝细胞中NF-κB较弱地表达，CLP组肝细胞NF-κB强阳性表达，而干预各组肝细胞NF-κB较CLP组表达弱。

黑木耳是人们日常生活中的常见真菌类植物，有药食两大功能，在《神农本草》和《本草纲目》中均有介绍，现代研究发现，黑木耳中的黑木耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血脂、抗氧化等多种生物活性。我们已发现黑木耳多糖在感染性休克、脓毒血症时具有抗炎作用，并且能保护心功能。在本实验中，应用黑木耳提取物给脓毒血症大鼠进行预防性灌胃，对大鼠的肝脏起到保护作用，其作用机制可能与抑制全身炎症反应有关。另外，通过不同的提取方式获得黑木耳多糖及黑木耳粗提物，这两种提取物对脓毒血症大鼠的保护作用没有显著差异，对于黑木耳提取物的有效成分还有待于进一步研究。

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ProtectiveeffectofA.auricula-judaeextractsonliverfunctioninsepticrats

SUN Zhan1, MA Xiao-juan2, YAO Xue-ping1, YU Wen-yan2, MA Qi1

(1LaboratoryofFunctionalScience;2DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China.E-mail:maqi1111@126.com)

AIM: To explore the effects ofAuricularia(A.)auricula-judaeextracts on the liver function in septic rats.METHODSForty male Wistar rats were randomly divided into control group, model group,A.auricula-judaepolysaccharide group andA.auricula-judaecrude extract group. Septic model was induced by the procedure of cecal ligation and puncture (CLP). Intragastric administration was performed every 8 h 3 days prior to CLP. The plasma levels of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), endotoxin(ET), tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin 6(IL-6) and IL-1β were detected 12 h after CLP. The specimens of the liver were collected to observe the pathological changes. The expression of NF-κB in the liver tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with the CLP rats, the intervention ofA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract to the septic rats significantly decreased the serum levels of ALT, AST, ET, TNF-α, IL-1β and IL-6 (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues in treatment groups were significantly attenuated compared with CLP group.CONCLUSIONA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract protect liver against sepsis-induced injury by inhibiting the systemic inflammatory response.

Auriculariaauricula-judaeextract; Sepsis; Liver function; Systemic inflammatory response syndrome

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.028

1000- 4718(2013)11- 2072- 04

2013- 04- 17

2013- 09- 24

国家自然科学基金资助项目(No. 81260454)

△通讯作者 Tel: 0991-4365064; E-mail: maqi1111@126.com