陈 舒， 罗 铭， 蔡望青， 李方成， 何志威， 刘安民△

(中山大学孙逸仙纪念医院 1神经外科， 2肿瘤科，广东 广州 510120； 3香港中文大学，中国 香港)

·实验技术·

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默*

陈 舒1， 罗 铭2， 蔡望青1， 李方成1， 何志威3， 刘安民1△

(中山大学孙逸仙纪念医院1神经外科，2肿瘤科，广东 广州 510120；3香港中文大学，中国 香港)

目的设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA)，构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI，与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine 2000共转染293T细胞，Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后，产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞，48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果经双酶切后测序鉴定，构建了MAGshRNA慢病毒载体pWPI-MAG，鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达，为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。

短发夹状RNA； 髓鞘相关糖蛋白； 慢病毒

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后的病理损伤机制至今尚不完全明确[1]。近来的研究发现，ICH后存在脱髓鞘的白质纤维损害，神经通路受损是ICH后神经功能的缺损重要原因[2]。近期我们研究发现，ICH后维持中枢神经系统神经纤维髓鞘结构和功能稳定重要结构的髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)显著升高，MAG是反映ICH后脱髓鞘病变的敏感标记物[3-4]。许多研究证实，髓鞘的相关抑制因子(如MAG等)是神经再生的关键抑制因素[5-6]。靶向干扰技术可沉默目的基因的表达[7-8]。本研究采用RNA干扰技术，构建重组慢病毒载体，筛选鉴定出的shRNA能高效、特异性抑制MAG的表达，为研究MAG调控髓鞘损伤和再生治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1主要试剂、质粒、菌种及细胞株

大肠杆菌DH5α和转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen，人少突胶质细胞株及293T细胞自ATCC引进。基因测试仪为ABI PRISM377 DNA测试仪，携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体系统pWPI 和其包装质粒pAX2、pMD2G由香港中文大学惠赠，pWPI具有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标志。限制性内切酶NotⅠ、PmeI和T4 DNA连接酶购自Bio-Lab，DNA聚合酶Klenow大片段购自Promega，质粒抽提试剂盒和逆转录试剂盒购自Qiagen，鼠抗人MAG单克隆抗体购自Santa Cruz，兔抗GFP多克隆抗体购自Abcam。

2MAG基因shRNA靶序列的设计

根据MAG(NM_017190.4)基因信息，设计shRNA1、shRNA2和shRNA3三条针对MAG基因编码序列区163～2043的siRNA序列。siRNA1：5’-GGAGAUGAAUUCCUCUGUGTT-3’；siRNA2：5’-GGUGUCACUGCUACACUUCTT-3’；siRNA3：5’-GGCGUCUGGUAUUUCAACATT-3’；同时设计一条序列negative用于对照组实验，通过BLAST验证该序列对于任何基因无干扰效果。阴性对照：5’-TTCTCCGAGCGTGCACGT-3’。根据上述4条shRNA序列，设计4对互补的单链DNA，包括shRNA的正义链和反义链，送上海吉玛公司合成。单链DNA的正义链序列按5’向3’顺序依次为：酶切位点(NotⅠ)、干扰序列(19 bp)、loop环、干扰序列的反向互补序列、终止信号和酶切位点(PmeⅠ)。

3将合成的shRNA序列插入到载体pWPI中

将合成的单链DNA片段退火形成双链DNA，分别定向克隆至NotⅠ和PmeⅠ双酶切后的空载体pWPI中，获得重组慢病毒载体，转化DH5α，涂布Amp抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。挑取阳性菌落接种于Amp+LB液体培养基中，将每个克隆进行测序鉴定。利用基因克隆时的引物, 运用DYEnamic ET terminator cycle 测序试剂盒在ABI PRISM377 DNA sequencer对pWPI-MAG中MAG基因进行自动测序, 与GenBank中正常MAG开放阅读框序列比较。测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提，用于后续细胞转染实验。

4有效干扰序列的筛选

用含有10%胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5%CO2培养箱中培养293T细胞，转染前24 h于6孔板中接种细胞，密度为1×105cells/well，待细胞生长至约70%汇片时换无血清DMEM培养基。将3种带有shRNA的重组慢病毒载体pWPI-MAG-shRNA1/2/3分别与真核表达载体混合物经LipofectamineTM2000共转染293T细胞，并设立空慢病毒载体作为对照。具体操作按试剂盒说明书进行。培养72 h后收集包含病毒的细胞，以Western blotting 法评定3种siRNA质粒转染的干扰效果，筛选出最有效的siRNA。

天啊，从2.6万到24万不等？看电影《唐山大地震》时，苏楠哭得一塌糊涂。难道，它比唐山大地震还惨烈？苏楠不信，继续搜。如果一切属实的话，这可是遂平继嵖岈山卫星人民公社之后又一件闻名全国的事件。

5慢病毒的包装与滴度测定

将293T细胞置于10 cm细胞培养盘中，培养过夜后将筛选出的重组慢病毒载体pWPI-shRNA与包装质粒pAX2和pMD2G共转染293T细胞。同时设立空载体为对照组。72 h后收集含病毒的细胞培养上清，并用0.45 μm孔径的滤器过滤。将粗提液进行慢病毒纯化和浓缩试剂盒纯化浓缩，-80 ℃保存。取出部分慢病毒浓缩液系列稀释后感染293T细胞，利用绿色荧光蛋白表达测定慢病毒滴度。

6慢病毒感染少突胶质细胞

将少突胶质细胞以1×109/L的密度接种于细胞培养瓶中，根据细胞数量和制备的3种病毒滴度，以感染复数(multiplicity of infection,MOI)不同值感染少突胶质细胞，同时添加polybrene至8 mg/L ，感染12 h后换液，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后于荧光显微镜下观察感染细胞阳性率。将备用的病毒液感染48 h后，目的细胞出现荧光，用于细胞的蛋白提取及检测实验。

7少突胶质细胞株中MAG蛋白表达的检测

用预冷的PBS溶液洗涤各组细胞3次，加入PMSF裂解液裂解细胞，放置冰上30 min，收集细胞裂解物至1.5 mL的EP管中离心抽提上清，用Bradford蛋白浓度测量试剂盒测定标本中蛋白质的浓度。每孔取10 μg上样进行SDS-PAGE电泳，然后将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，200 V、1.5 h。用含有5%脱脂奶粉Tris缓冲液封闭1 h后，加入1∶500稀释的兔抗MAG多克隆抗体，37 ℃孵育1 h。用TBST洗膜3次后，加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，继续孵育1 h。洗膜3次后，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，显影。以β-actin作为内参照。

8统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，各组资料间的比较采用Student’st检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

构建含有MAG-shRNA的重组慢病毒质粒，经转化大肠杆菌DH5α后提取质粒，与空载体均经NotⅠ和PmeI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定。shRNA1、shRNA2和shRNA3质粒DNA测序结果证实重组的RNA干扰慢病毒载体均有一段与实验设计合成的靶向链相符。测序结果显示, pWPI-MAG中MAG序列与GenBank NM_017190.4 中MAG序列一致，重组pWPI-MAG构建成功，见图1。

Figure 1. Partial sequencing maps of pWPI-MAGpositive clones. A:shRNA1; B:shRNA2; C:shRNA3.

图1pWPI-MAG阳性克隆的部分序列

2慢病毒滴度测定和细胞的感染效率

重组慢病毒载体在293T细胞中成功组装并浓缩。应用浓缩系列稀释后感染293T细胞，通过观察绿色荧光蛋白表达测定慢病毒滴度，病毒滴度均可达1012TU/L。构建的3种重组慢病毒载体pWPI-MAG-shRNA1/2/3均可有效感染293T细胞，感染效率无明显差异(P>0.05)，且随MOI的增加感染效率也随之增加，在MOI=10～500时，增加最为明显，而MOI <10时，感染效率较低，而>500时感染效率进入平台期。在MOI=50的情况下，感染效率均可达70%～90%，见图2。

Figure 2. pWPI-MAG-shRNA transfected into 293T cells (×200).A:light microscope;B:fluorescence microscope.

图2pWPI-MAG-shRNA转染至293T细胞

3有效干扰MAG表达质粒的筛选

收集病毒感染的293T细胞，提取总蛋白进行Western blotting检测，结果显示，siRNA2组干扰效果最好，MAG的表达明显被抑制，而shRNA1/3、control shRNA及空质粒组几乎没有干扰效果，见图3。

Figure 3. The MAG protein expression in 293T cells. Control:empty plasmid transfection.

图3MAG特异性shRNA对293T细胞MAG蛋白表达的影响

4慢病毒载体抑制少突胶质细胞MAG蛋白的表达

将筛选出的重组慢病毒载体pWPI-MAG-shRNA2与包装质粒pAX2和pMD2G共转染293T细胞，利用合成的pWPI-MAG-shRNA病毒液可直接感染少突胶质细胞，48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，发现转染效率达80%。将感染了pWPI-MAG-shRNA的少突胶质细胞继续培养，获得可以稳定低表达MAG的少突胶质细胞株。Western blotting检测结果显示，pWPI-MAG-shRNA2转染的少突胶质细胞株MAG蛋白的表达明显降低，见图4。

讨 论

在我国ICH发病率为每年60～80人次/10万人口，ICH急性期病死率高，即使幸存者中约有75%不同程度丧失劳动能力，重度致残者占40%以上，给社会和家庭带来了巨大的负担。由于对ICH的发病机制尚未完全阐明，临床实践中还缺乏统一和有效的治疗方法。ICH后的占位效应可对邻近的组织产生机械压迫和损伤，导致相应的神经功能表现[1]。近来研究发现，ICH后可引起血肿周围髓鞘和轴索损伤，维持神经纤维髓鞘结构和功能稳定的MAG等出现明显改变；由此导致的脱髓鞘损伤是ICH后神经功能缺损的重要原因[2-4]。

Figure 4. Protein expression of MAG in oligodendrocytes after lentivirus infection detected by Western blotting. Control: empty plasmid transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

图4Westernblotting检测慢病毒感染少突胶质细胞后MAG蛋白的表达

MAG是一种跨膜糖蛋白，定位于直接和轴突相接触的髓鞘膜的最里层，它通过介导胶质细胞与轴突的相互作用参与髓鞘的形成及其完整性的维持；MAG在髓鞘和轴突界面的特殊定位以及它在发育中的早期表达，提示该分子可能介导了轴突与胶质细胞间的早期相互作用，参与髓鞘化的启动及髓鞘化轴突与胶质突起之间稳定连接的维持[9]。MAG在中枢神经系统中有维持髓鞘完整性和抑制中枢神经系统轴突再生的作用[5-6]；而通过免疫耗竭法除去MAG后，可明显减少髓鞘对轴突生长的抑制作用[9]。在合适的微环境下可以利于髓鞘的再生，即可以通过抑制阻碍再生和增强促进再生的因素来促进神经的再生能力[10]。因此，对MAG与ICH后髓鞘损伤的关系研究，有助于进一步阐明髓鞘损伤机制，为髓鞘再生的治疗寻找新的分子治疗靶点。

RNA干扰是由双链RNA介导的、在mRNA水平关闭相应基因表达的过程，具有普遍性、高效性、特异性和记忆性，以及简单、快速关闭特定基因功能的优点[11]。利用RNA干扰技术能够在转录后水平高效特异地阻断基因的表达通路，影响信号转导的下游反应[7-8]。依据RNA干扰的技术原理，本研究首先设计了3条靶向MAG基因的shRNA片段，其相对分子量小，如果直接瞬时转染至细胞中，干扰作用效果不持久。由于重组慢病毒基因转移方法具有高效、快速和持续表达等优点[3-4,7-8，11]，为RNA干扰技术应用于治疗创造可能。本实验将重组质粒与真核表达载体共转染293T细胞，筛选到有效的干扰序列为shRNA2;进一步将针对MAG的干扰载体稳定转染人少突胶质细胞，发现干扰载体shRNA2对MAG基因有显著沉默效果，带有干扰序列shRNA2的重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞内MAG蛋白的表达。这为深入研究MAG在髓鞘损伤的发病机制和髓鞘再生的靶向治疗奠定基础。

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ConstructionofshorthairpinRNAlentiviralvectortargetingMAGgeneanditssilencingeffectonMAGgene

CHEN Shu1, LUO Ming2, CAI Wang-qing1, LI Fang-cheng1, HE Zhi-wei3, LIU An-min1

(1DepartmentofNeurosurgery,2DepartmentofOncology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3TheChineseUniversityofHongkong,Hongkong,China.E-mail:docliuam@yahoo.com.cn)

AIM: To construct lentiviral vector-based short hairpin RNA (shRNA) targeting myelin-associated glycoprotein (MAG) gene and to evaluate its inhibitory effect on the expression ofMAGgene.METHODSThree shRNA fragments targetingMAGgene (shRNA1, shRNA2 and shRNA3) were designed and cloned into lentiviral vector pWPI. The three recombinant plasmids were identified by enzyme digestion and sequencing. Positive plasmids were co-transfected with pCDNA3-MAG-FLAG into 293T cells, and the most effective shRNA for knockdown ofMAGgene was screened by Western blotting. Cells transfected with empty pWPI served as a control. Oligodendrocytes were infected with recombinant lentivirus that was produced by 293T packaging cells co-transfected with the most effective shRNA, pAX2 and pMD2G. After 48 h, the expression of MAG protein was measured by Western blotting.RESULTSTheMAGshRNA lentiviral vectors were confirmed by double enzyme digestion and sequencing, and shRNA2 showed the highest inhibitory efficacy among the three shRNA fragments. Recombinant lentivirus carrying shRNA-2 markedly decreased the expression of MAG protein in oligodendrocytes.CONCLUSIONLentiviral vector-based shRNA targetingMAGgene specifically knocks down the gene expression, which provides a useful tool for investigating the role ofMAG-specific shRNA in regulating myelination of central nerve system.

Short hairpin RNA; Myelin-associated glycoprotein; Lentivirus

R737.25

A

1000- 4718(2013)09- 1725- 04

2013- 03- 19

2013- 07- 12

广东省自然科学基金资助项目(No. S2011010002638); 广东省科技社会发展项目(No. 2012B031800356)

△通讯作者 Tel: 020-81332016; E-mail: docliuam@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.034