喻守佳, 王海英, 喻 田, 刘兴奎

(遵义医学院附属医院麻醉科，贵州 遵义 563003)

Nrf2-ARE通路在缺氧/吡那地尔后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用*

喻守佳, 王海英△, 喻 田, 刘兴奎

(遵义医学院附属医院麻醉科，贵州 遵义 563003)

目的探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)通路在缺氧后处理和吡那地尔后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法建立成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型，分离、培养心肌细胞，随机分为6组(n=8)：正常组(N组)、模型组(M组)、缺氧后处理组(IPO组)和不同浓度吡那地尔后处理组(P25组、P50组和P100组)。分离后的心肌细胞培养20 h后，除N组继续培养外，其余各组均缺氧45 min，复氧60 min。IPO组缺氧45 min后复氧、缺氧循环3次，每次各5 min，在继续复氧60 min；P25组、P50组和P100组缺氧45 min后分别以25、50和100 μmol/L吡那地尔处理5 min，复氧60 min。采用real-time PCR及Western blotting技术检测复氧末心肌细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)和超氧化物歧化酶1(SOD1) mRNA及蛋白表达水平。结果与N组比较，其它各组与Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的mRNA及蛋白质表达均降低(P<0.05)；与M组比较，其它各组mRNA及蛋白质表达均显著增高(P<0.05)；其中IPO组和P50组mRNA转录量显著高于P25组和P100组(P<0.05)；P25组SOD1 mRNA显著高于P100组(P<0.05)。IPO组和P50组Nrf2、SOD1和NQO1蛋白质表达显著高于P25和P100组(P<0.05)；P50组HO-1蛋白质表达量显著高于IPO组、P25组和P100组(P<0.05)；P25组HO-1和NQO1蛋白质表达显著高于P100组(P<0.05)。结论缺氧后处理和吡那地尔后处理可能通过激活Nrf2-ARE通路减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤。

核因子E2相关因子2； 吡那地尔； 缺氧复氧损伤； 心肌细胞； 后处理

核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路可通过诱导心肌细胞表达一系列抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶，发挥心肌保护效应[1]。研究证实，缺氧后处理和吡那地尔(pinacidil，P)后处理心肌保护作用明确[2-3]，但具体机制仍不十分清楚，Nrf2-ARE通路是否参与了缺氧后处理和吡那地尔后处理的心肌保护作用机制尚有待探讨。本研究拟评价Nrf2-ARE通路在缺氧后处理和吡那地尔后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物选择和分组 健康雄性清洁级SD大鼠，体重250～300 g，4～5月龄(由第三军医大学试验动物中心提供，动物证书号为SCXK(渝)2007-0005。将分离培养过夜后的心肌细胞随机分为6组(n=8)：正常组(N组)、模型组(M组)、缺氧后处理组(IPO组)和不同浓度的吡那地尔后处理组(P25组、P50组和P100组)。

1.2主要试剂 吡那地尔、M199培养基、层黏连蛋白(laminin)、HEPES、肌酸(creatine)、牛磺酸(taurine)、牛血清白蛋白、EGTA、粗制Ⅱ型胶原酶等以上试剂均购自Sigma。BCA蛋白浓度测定试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所提供。逆转录试剂盒和real-time PCR试剂盒均购自大连TaKaRa生物工程公司。所用引物由大连TaKaRa生物工程公司根据设计合成，见表1。

1.3主要仪器 2400PCR扩增仪(PE)、实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad),Odyssey红外荧光成像系统(基因有限公司)和Mini Trans-Bloe电泳仪(Bio-Rad)。

2方法

2.1分离培养成年大鼠心肌细胞 腹腔注射异戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)和肝素(250 U·kg-1)后迅速沿剑突下打开胸腔，于主动脉根部剪下心脏，放入37 ℃ 750 μmol/L Ca2+液中。迅速将主动脉固定于Langendorff灌注管口，分别灌注氧合的750 μmol/L Ca2+液2 min、100 μmol/L无Ca2+EGTA液4 min、0.1% Ⅱ型胶原酶液15～20 min后剪开心肌，加入含有1% BSA的循环Ⅱ型胶原酶液，在氧合情况下振荡消化5 min，37 ℃水浴中自然沉降，收集沉淀。向沉淀中加入新鲜的酶洗脱液洗涤3次，加入细胞培养基M199洗涤2次。将细胞数以104/cm2的密度平铺于层黏连蛋白于6孔板中，加入M199培养3 h后，去除未贴壁细胞，重新加入新鲜M199培养过夜。

表1 引物序列

2.2心肌细胞缺氧复氧模型的建立 各组心肌细胞均培养20 h，除N组继续培养外，其余各组均缺氧45 min，复氧60 min。IPO组缺氧45 min后复氧、缺氧循环3次，每次各5 min，再继续复氧60 min；P25组、P50组和P100组缺氧45 min后分别以25、50和100 μmol/L吡那地尔处理5 min，复氧60 min。

2.3透射电镜下观察心肌细胞超微结构 各组贴壁的心肌细胞经0.1%胰酶消化，2%戊二醛固定，修整包埋后制作超薄切片，通过透射电镜观察每组心肌细胞的超微结构。

2.4Real-time PCR检测心肌细胞Nrf2、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)mRNA表达 培养后的心肌细胞经Trizol一步法提取总RNA，通过紫外分光光度计检测总RNA的含量及纯度后按照逆转录试剂盒合成cDNA，逆转录产物作为下一步PCR模版，PCR扩增所用的寡核苷酸引物序列(表1)均由大连宝生物工程公司合成。按照real-time PCR试剂盒说明书进行操作，4倍梯度稀释模板cDNA制作标准曲线，确认各个基因的扩增效率，确定cDNA上样浓度。根据反应条件在每个循环延伸末端收集荧光信号，绘制扩增曲线。40个循环后设置反应步骤，对55 ℃到95 ℃升温过程，每个0.5 ℃采集荧光信号，绘制融解曲线，采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量，以检测心肌细胞中Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA表达水平。

2.5Westem blotting法检测Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白的表达 于培养后向各组心肌细胞中加入RIPA裂解液3～5 s， 4 ℃、14 000×g冷冻离心5 min。上清液经碧云天公司的BCA蛋白质定量试剂盒定量后分装成40 μg/10 μL，-20 ℃冻存。按照Bio-Rad公司的SDS-PAGE电泳使用说明行蛋白质电泳，电泳结束后按照Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的分子量切取凝胶，并进行转膜和封膜。每个目标蛋白分别封闭I抗，PBS洗膜后再封闭荧光II抗，Odyssey红外荧光成像系统扫描PVDF膜，记录各组蛋白条带相应的荧光强度值。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1缺氧/吡那地尔后处理对细胞超微结构的影响

透射电镜观察发现N组细胞超微结构形态基本正常；M组破坏程度最严重，电镜下心肌细胞线粒体肿胀、空泡，嵴断裂成絮状，部分线粒体已溶解破裂，核膜溶解消失，细胞核溶解形状不规则；而P25组和P100组破坏程度较M组轻，电镜下可见部分线粒体肿胀，嵴模糊或断裂成絮状，核膜基本较完整，细胞核皱缩；IPO组和P50组超微结构线粒体轻度肿胀，嵴平行或少数断裂，核膜较完整，细胞核轻度皱缩，完整性明显优于M组、P25组和P100组，见图1。

Figure 1. Changes of the myocardial cell ultrastructure observed under transmission electron microscope (×20 000).

图1透射电镜观察心肌细胞超微结构

2缺氧/吡那地尔后处理对细胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1mRNA表达的影响

与N组比较，其它各组与Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1 mRNA表达均明显降低(P<0.05)；与M组比较，其它各组mRNA表达均显著增高(P<0.05)；IPO组和P50组mRNA转录量显著高于P25和P100组(P<0.05)；P25组SOD1 mRNA显著高于P100组(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1 mRNA表达量的变化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

3缺氧/吡那地尔后处理对细胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表达的影响

与N组比较，其它各组与Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表达均明显降低(P<0.05)；与M组比较，其它各组蛋白表达均显著增高(P<0.05)；P50组HO-1蛋白表达量显著高于IPO组、P25组和P100组(P<0.05)；P25组HO-1和NQO1蛋白表达显著高于P100组(P<0.05)，见图2、表3。

Figure 2. Expression of Nrf2,SOD1,HO-1 and NQO1 proteins in myocardial cells in each group detected by Western blotting.

图2各组心肌细胞Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1及GAPDH蛋白表达的免疫印迹图

表3 各组大鼠心肌细胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1蛋白质表达量的变化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

讨 论

本研究表明，缺氧后处理和不同浓度吡那地尔后处理均能减轻心肌细胞超微结构的破坏程度，从而起到保护缺氧心肌细胞的作用。结合既往的研究及本研究的预实验结果，本研究选择25、50和100 μmol/L吡那地尔。Nrf2及其下游NQO1、SOD1和HO-1表达上调是Nrf2-ARE通路被激活的标志[4]，本研究检测到缺氧后处理和吡那地尔后处理均导致了这些基因表达上调。证实缺氧后处理和吡那地尔后处理可能通过激活Nrf2-ARE通路减轻心肌缺氧复氧损伤。

本研究观察到50 μmol/L吡那地尔处理组Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1表达水平高于25 μmol/L组和100 μmol/L组，且最大限度地降低了细胞内超微结构的损伤，说明50 μmol/L吡那地尔处理组抗心肌氧化应激强于25 μmol/L和100 μmol/L组，最大限度地保护了心肌细胞。其机制可能是50 μmol/L吡那地尔后处理激活Nrf2-ARE通路及其Ⅱ相解毒酶下游基因表达上调的作用最强。

研究发现，药物预处理能激活Nrf2-ARE通路，其Ⅱ相解毒酶下游基因表达上调，从而起到抗氧化应激作用，发挥心肌保护效应，且线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATPC)开放可能参与激活了Nrf2-ARE通路[5]。因此，本研究推测缺氧后处理及吡那地尔后处理，心肌细胞mitoKATPC开放，诱使Nrf2-ARE通路活化，以对抗缺氧再灌注期所致的氧化损伤。减少钙超载，保护线粒体结构形态，发挥心肌保护效应。

综上所述，缺氧后处理和吡那地尔后处理可通过激活Nrf2-ARE通路减轻心肌缺氧复氧损伤，吡那地尔后处理可替代缺氧后处理产生心肌保护作用。

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RoleofNrf2-AREsignalingpathwayinprotectiveeffectofhypoxiaorpinacidilpostconditioningagainsthypoxia-reoxygenationinjuryinadultratcardiomyocytes

YU Shou-jia, WANG Hai-ying, YU Tian, LIU Xing-kui

(DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:wanghaiting-8901@163.com)

AIM: To investigate whether nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE) signaling pathway is involved in the protective effect of hypoxia or pinacidil postconditioning against hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes.METHODSCardiomyocytes were isolated from the left ventricle of male adult Sprague-Dawley rats (250～300 g) by Langendorff perfusion and collagenase II digestion. The cells were randomly divided into six groups (n=8 in each group). The cells in N group were cultured for 22 h without any treatment. The cells in the other five groups were cultured for 20 h and then underwent 45 min of hypoxia followed by 60 min of reoxygenation (M group), three 5-min cycles of reoxygenation/hypoxia plus 60 min of reoxygenation (IPO group), or treatment with pinacidil (25, 50 and 100 μmol/L) for 5 min plus 60 min of reoxygenation (P25, P50and P100groups, respectively). The expression of Nrf2, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1) and superoxide dismutase 1 (SOD1) at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting, respectively.RESULTSThe mRNA and protein levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in M, IPO, P25, P50and P100groups were significantly decreased compared with N group (P<0.05), and those in IPO, P25, P50and P100groups were obviously higher than those in M group (P<0.05). The mRNA levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The mRNA expression of SOD1 in P25group was obviously higher than that in P100group (P<0.05). The protein levels of Nrf2, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The protein expression of HO-1 in P50group was obviously higher than that in IPO, P25and P100groups (P<0.05). The protein levels of HO-1 and NQO1 in P25group were obviously higher than those in P100group (P<0.05).CONCLUSIONHypoxia or pinacidil postconditioning may attenuate hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes via activation of Nrf2-ARE signaling pathway.

Nuclear factor E2-related factor 2; Pinacidil; Hypoxia-reoxygenation injury; Cardiomyocytes; Postconditioning

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1696- 05

2013- 03- 02

2013- 07- 17

国家自然科学基金资助项目(No.30960366)

△通讯作者Tel：0852-8609838；E-mail:wanghaiting-8901@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.028