施庆颜, 靳 华, 蓝 田, 李 娟, 黄世光△

(1暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632； 2武警广东省总队医院口腔科，广东 广州 510507)

缺氧诱导因子1α在人慢性牙周炎牙龈组织中的表达*

施庆颜1, 靳 华2, 蓝 田1, 李 娟1, 黄世光1△

(1暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632；2武警广东省总队医院口腔科，广东 广州 510507)

目的观察人慢性牙周炎牙龈组织中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达水平，探讨HIF-1α在牙周炎发病中的可能作用。方法将55例自愿接受研究的牙周炎患者按照牙周炎的病变程度分成3组：正常对照组15例、中度牙周炎组20例和重度牙周炎组20例。取牙龈组织标本，4%中性甲醛液固定48 h以上。制作牙龈组织的连续切片，HE染色，光学显微镜下观察各组牙龈组织的组织学改变；免疫组织化学染色法观察各组牙龈组织HIF-1α的表达水平。结果(1) 与正常对照组相比，各慢性牙周炎组的牙龈组织HIF-1α的表达水平显著升高(P<0.01)；(2) 重度牙周炎组HIF-1α阳性细胞比例明显高于中度牙周炎组(P<0.05)；(3) HIF-1α 阳性细胞比例与牙周炎的病变程度呈正相关。结论人慢性牙周炎牙龈组织中HIF-1α 的表达水平随着牙周炎病变程度的加重而升高，提示组织缺氧可能在牙周炎的疾病进程中起着重要的作用。

牙周炎； 缺氧诱导因子1α； 缺氧

牙周炎是由菌斑微生物作为始动因子引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病[1]。缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)是组织细胞在缺氧状态下由激活基因所编码的转录因子。越来越多的研究表明HIF-1α在感染和免疫方面发挥重要作用[2]。牙周炎发生时，组织炎症肿胀导致局部组织缺血、缺氧诱导HIF-1α的表达，HIF-1α可在IL-1β等炎症因子的激活下增强破骨细胞活性或协同其它细胞因子间接加速破骨细胞活动。我们前期的研究显示，心理应激刺激通过增加牙周组织HIF-1α的表达降低牙周组织氧代谢水平，从而加重大鼠牙周炎症程度[3-4]。然而，目前关于HIF-1α在人慢性牙周炎中的表达情况尚无文献报道。本研究通过检测HIF-1α 蛋白在人慢性牙周炎牙龈组织的表达情况来判断组织的氧代谢情况，探讨慢性牙周炎的炎症程度与HIF-1α 表达的关系。

材 料 和 方 法

1研究对象

1.1牙周炎病例选择 选择2011年～2012年在暨南大学荔湾口腔教学医院牙周科门诊就诊的自愿接受本研究的牙周炎患者，年龄为20～65岁，其中男性37名(43岁±12岁)，女性28名(45岁±12岁)，各实验组在年龄、性别上差异无统计学意义。受试者均无糖尿病和其它系统性疾病；6个月内无服用抗生素药物；无食物、药物过敏史；非孕妇或服用避孕药的妇女；1年内没有进行牙周手术治疗。纳入标准依据美国牙周病学会1999年的牙周病新分类指南[5]；所有受试者均签署知情同意书。

1.2分组 (1)正常对照组：取自因正畸治疗需要拔除的正常前磨牙且牙周健康者，无牙周袋，无附着丧失，X线片显示无牙槽骨吸收，牙龈无炎症，共15 例；(2)中度牙周炎组: 牙龈有炎症，探诊出血，牙周袋4～6 mm，附着丧失3～4 mm，牙槽骨吸收在根长1/3～2/3以内，共20例，为慢性牙周炎接受牙周翻瓣术者；(3)重度慢性牙周炎组: 牙周袋>6 mm，附着丧失≥5 mm，牙齿松动Ⅲ度，牙槽骨吸收超过根长2/3以上，共20例，为无保留价值或预后极差的牙周炎患牙需要拔除者。

2方法

2.1组织标本采集、处理与观察 牙龈标本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成5 μm厚度牙龈组织连续切片，HE染色，光学显微镜下观察牙龈的组织学改变。由2名病理医师盲法观察，并对牙龈组织的炎性细胞浸润情况进行评分，求其平均值。炎症程度评分标准参照Huang等[4]的方法：0分,无炎症细胞浸润；1分,轻度炎症，炎症细胞局部呈小灶状浸润；2分,中度炎症，炎症细胞呈灶状及片状浸润；3分,重度炎症，炎症细胞在牙龈组织内呈弥漫性浸润。

2.2HIF-1α免疫组织化学染色及评分标准 采用免疫组织化学SP法对牙龈组织进行染色，I抗HIF-1α(Millipore)，稀释浓度为1∶150，DAB显色液显色。阴性对照采用PBS缓冲液代替I抗，苏木素复染。免疫组化阳性信号为棕黄色细小颗粒，定位于细胞核或细胞浆。每个切片计数5个200倍视野下总细胞数及阳性细胞数，计算阳性细胞比例。由2名病理医师于光镜下观察细胞形态并计数，取其平均值，为该标本的阳性细胞比例。免疫组化染色评分标准参照Huang等[4]的方法：0，无染色；+，阳性细胞比例<1%；++，阳性细胞比例为1%～10%；+++，阳性细胞比例为10%～40%；++++，阳性细胞比例为40%～70%；+++++,阳性细胞比例为>70%。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 13.0 统计学软件进行分析处理。不同组间牙龈组织炎症程度评分和HIF-1α免疫组化染色阳性细胞比例的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验分析。牙周炎炎症程度和HIF-1α免疫组化染色得分之间的相关性采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1组织学改变

牙龈组织的组织学改变见图1。正常对照组几乎没有炎症细胞浸润(图1A)；中度牙周炎组见少量散在慢性炎症细胞浸润(图1B)；重度牙周炎组可见大量慢性炎症细胞浸润，出现大范围的淋巴细胞、浆细胞和单核细胞浸润，并可见散在分布的多形核细胞和巨噬细胞(图1C)。

Figure 1. Representative photomicrographs of human gingival tissues (HE staining,×200). A：no inflammatory infiltration in clinically healthy gingival tissues; B：moderation inflammatory infiltration in moderate chronic periodontitis group; C：intense inflammatory infiltration in severe chronic periodontitis group.

图1各组牙龈组织观察

2HIF-1α免疫组织化学染色结果

HIF-1α免疫组化染色结果见图2。正常对照组牙龈组织中见少量弱阳性细胞(图2A)；中度慢性牙周炎组牙龈组织见较多的HIF-1α阳性细胞(图2B)，重度牙周炎组(图2C)HIF-1α阳性表达明显高于中度牙周炎组。各组阳性细胞比例见图3。与正常对照组(6.21%±0.86%)相比，慢性牙周炎牙龈组织HIF-1α 的阳性表达显著升高(P<0.01)；重度牙周炎组牙龈组织HIF-1α 的阳性表达(83.47%±3.09%)明显高于中度牙周炎组(68.57%±2.06%，P<0.05)。

Figure 2. Immunohistochemical staining for HIF-1α protein in human gingival tissues(×400). Positively stained cells can be visualized by the brown nuclei. In clinically healthy group (A), positive nuclear staining was observed <10%of cells or with distinct cytoplasm. In moderate chronic periodontitis group (B), positive nuclear staining was observed in 40% to 70% of cells.In severe chronic periodontitis group (C),positive nuclear staining was observed in >70% of cells or with strong cytoplasmic staining.

图2各组牙龈组织中HIF-1α的表达

Figure 3. Scores of inflammation and HIF-1α expression in gingival tissues.A: healthy control (n=15); B: moderate chronic periodontitis group (n=20); C: severe chronic periodontitis group (n=20).Mean±SD.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB.

图3各组牙周炎炎症程度和HIF-1α免疫组化染色评分比较

3牙周炎炎症程度与HIF-1α表达的相关性分析

图3表明随着牙周炎的病变程度增加，牙龈组织的炎症程度加重；重度牙周炎组的炎症评分显著高于中度牙周炎组(P<0.01)；同时，随着牙周炎的病变程度增加，HIF-1α免疫组化的得分也随之增加。经Pearson相关分析，牙周炎炎症程度与牙龈组织HIF-1α的表达水平密切相关，且呈正相关关系(r=0.864,P<0.05)。

讨 论

牙周炎是导致成人牙齿丧失的最主要病因，其致病机制尚未清楚。牙周炎时，牙龈组织肿胀导致牙周微环境处于缺氧状况，各种促炎细胞因子升高。组织在缺氧状态下，细胞内缺氧反应基因转录和表达发生改变，从而对缺氧做出应激反应，组织出现一系列适应性变化。缺氧反应基因的调控主要通过HIF-1α来实现。以往对HIF-1α的研究主要集中于血管生成、肿瘤等方面，最近的研究表明HIF-1α在炎症过程中也发挥着重要作用[6-7]，HIF-1α在人慢性牙周炎的表达尚未见报道。HIF-1α是低氧应答时诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的一个核心调节因子。在缺氧条件下，细胞产生HIF-1α与靶基因中的HRE结合点结合，促进其转录，引起一系列细胞对泛氧的反应，以保持机体的氧稳态[8-9]。

HIF-1α作为缺氧条件下细胞应答的调控因子，许多研究表明其与肿瘤的发生、预后及治疗反应存在密切关系。研究发现，在胰腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌中HIF-1α与增殖细胞核抗原呈正相关[10]。研究表明缺氧明显影响组织细胞对细胞因子的表达，如IL-1β、前列腺素E2和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等[11]。研究证实TNF-α是破骨细胞分化的协同刺激因子，TNF-α能通过刺激破骨细胞的分化和成熟，或作用于骨基质，使破骨细胞暴露并与其相互作用[12-13]。HIF-1α通过其靶基因如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转化生长因β等间接调节破骨细胞的形成和活化[14-16]。在缺氧状态下，由于机体血液黏滞度增高，微循环血流减慢，造成血管管腔狭窄，甚至形成血栓，导致牙周组织供氧不足，从而有利于牙周致病菌的生长，降低了牙周组织的防御和修复能力，同时，无氧代谢增强，有害物质也随之增加[17-18]。Motohira等[19]研究表明，缺氧条件下刺激牙周膜细胞产生VEGF，VEGF可分别通过细胞外信号调节激酶1/2依赖机制和VEGF-Flt-1-FAK途径介导破骨细胞前体细胞的趋化性和破骨细胞的形成，导致牙槽骨吸收。我们前期的研究证明心理应激增加HIF-1α在牙周炎组织中的表达，其表达程度与牙周炎的病变程度密切相关[4]，提示心理应激可能通过降低牙周组织局部的氧代谢水平，使局部组织处于缺氧状态，促使HIF-1α的表达升高，参与牙周病的炎症进程。

我们的结果显示,HIF-1α在慢性牙周炎牙龈组织中的表达显著高于正常牙龈组织，其表达强度随着牙周炎病变程度的加重而明显增强。这提示牙周炎存在明显的缺氧状况，缺氧引起的基因表达改变可能是牙周炎发病和疾病进程中的一个关键环节。此外，HIF-1α也是重要的炎症和免疫反应因子[20-21]，其表达增强除了表明组织氧代谢降低外，还可能参与炎症进程的调节，与炎症发展有着多方面的联系。组织缺氧加重HIF-1α 的大量产生，一方面直接损伤牙周组织，影响牙周组织的代谢和修复，另一方面上调了炎症的NF-κB信号通路，炎症介质在牙周组织中过表达，介导组织的免疫损伤，产生级联放大效应，进一步加重了牙周组织破坏和微血管循环障碍，从而加速了牙周炎病变的进程[22-23]。

综上所述，HIF-1α表达增强表明牙周组织氧代谢降低，同时HIF-1α表达强度与牙周炎的病变程度密切相关，提示其可能参与牙周炎的病变进程。本研究结果对阐明牙周炎的发病机制及为牙周炎辅助治疗提供了理论依据。

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Expressionofhypoxia-induciblefactor1αinhumangingivaltissueswithchronicperiodontitis

SHI Qing-yan1, JIN Hua2, LAN Tian1, LI Juan1, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofStomatology,ArmedPoliceHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510507,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To observe the expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in human gingival tissues with chronic periodontitis.METHODSA total of 55 volunteers, including 15 healthy controls, 20 cases of moderate chronic periodontitis and 20 cases of severe chronic periodontitis, were involved in this study, and their gingival specimens were taken and fixed in 4% neutral formalin. The histological changes of gingival tissues were observed by HE staining, and the expression of HIF-1α in gingival tissues was detected by immunohistochemical staining.RESULTSThe proportion of HIF-1α positive cells in gingival tissues was significantly higher in chronic periodontitis groups than that in healthy control group (P<0.01), and that in severe chronic periodontitis group was significantly higher than that in moderate chronic periodontitis group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between the severity of chronic periodontitis and the proportion of HIF-1α positive cells in gingival tissues.CONCLUSIONThe expression of HIF-1α in human gingival tissues is increased with the severity of chronic periodontitis, suggesting that hypoxia may play an important role in chronic periodontitis.

Periodontitis; Hypoxia-inducible factor 1α; Hypoxia

R781

A

1000- 4718(2013)09- 1668- 04

2013- 03- 30

2013- 07- 02

广东省医学科研基金资助项目(No.A2013454)

△通讯作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.023