曹军军， 杨茂伟， 郭宝磊， 梁 单

(中国医科大学附属第一医院骨外科，辽宁 沈阳 110001)

枸橼酸铁铵通过提高ROS水平激活MAPK通路并诱导成骨细胞凋亡*

曹军军， 杨茂伟△， 郭宝磊， 梁 单

(中国医科大学附属第一医院骨外科，辽宁 沈阳 110001)

目的探讨铁超载提高人成骨细胞(hFOB1.19)活性氧(ROS)水平在激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和诱导细胞凋亡中的作用。方法采用细胞贴壁法培养成骨细胞hFOB1.19，将不同浓度枸橼酸铁铵(100、300、500 μmol/L)加入细胞培养基，用MTT法检测成骨细胞增殖活性；DCFH-DA荧光探针检测成骨细胞ROS水平；Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡；Western blotting检测MAPK通路相关蛋白。结果枸橼酸铁铵处理成骨细胞后，细胞增殖活性明显降低，早期凋亡和总死亡率显著增加；不同浓度的枸橼酸铁铵处理成骨细胞后，其ROS水平分别增高至(35.73±2.52)%、(62.89±4.24)%和(76.06±3.55)%，MAPK通路相关蛋白的表达也明显增加并呈剂量效应关系，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以在降低ROS水平及MAPK通路相关蛋白表达的同时抑制枸橼酸铁铵所致的细胞凋亡。结论枸橼酸铁铵能使成骨细胞增殖受到抑制，并且通过增加细胞内ROS水平，激活MAPK通路，诱导成骨细胞凋亡。

铁； 成骨细胞； 细胞凋亡； 活性氧； MAPK信号通路

铁是人体必需营养元素，广泛参与机体生理功能和生化反应[1]。当罹患血色素沉着病等疾病时，机体内过多的铁可引起骨量减少，导致骨质疏松[2]。同时，骨组织年龄相关的铁沉积与绝经后骨质疏松有关[3]。这些都证实了铁超载与骨质疏松之间的关系。相关研究表明，枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate，FAC)可以通过增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平和激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)从而引起成骨细胞存活率的降低，导致骨质疏松[3]。但铁超载通过何种途径引起的成骨细胞数量减少，目前仍不明确。本实验通过用FAC干预细胞，观察细胞内ROS水平以及与其相关的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的激活，初步探讨铁超载所致成骨细胞毒性的机制。

材 料 和 方 法

1材料

人成骨细胞株hFOB1.19购自美国培养物保存中心(ATCC，CRL-2593)，DMEM(高糖)/F12培养基购于Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于HyClone，噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和FAC购于Sigma，细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 抗体购于Santa Cruz，p38 抗体购于CST，抗鼠和抗兔Ⅱ抗购于北京中杉公司。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC) 购于碧云天公司， 2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯( 2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA) 购于Molecular Probes。

2细胞培养

人hFOB1.19细胞培养于含10%FBS、0.3 g/L G418、DMEM(高糖)/F12=1∶1的培养基当中，置于34 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，0.25%胰酶常规消化传代。实验分为4组：正常组、FAC100、300、500 μmol/L组。将上述浓度的FAC加入细胞培养基内培养，正常组加入不含FAC的培养基。

3细胞体外生长活性检测

取对数生长期的hFOB1.19细胞，以5×107/L密度接种于96孔板当中(100 μL/well)，培养24、48、72 h后，加入不同浓度枸橼酸铁铵的培养基(100 μL/well)，使枸橼酸铁铵终浓度为0、50、100、150、300、500、800、1 200、1 500 μmol/L，重复设置6孔加药作用24、48、72 h后弃掉培养基，向每孔分别加入20 μL 5 g/L MTT储存液，并于37 ℃孵育4 h吸出MTT后，向每孔加入150 μL DMSO，酶标仪570 nm波长测定吸光度，按照抑制率(%) =(A570正常-A570加药)/A570正常×100%，计算出半数抑制浓度(IC50)。

4细胞凋亡检测

采用Annexin V-FITC/PI法检测。取对数生长期的hFOB1.19细胞，接种于100 mm培养皿中。培养24 h后，加药作用24 h。离心收集细胞，用冰冻的PBS洗细胞2次。用200 μL binding buffer重悬细胞后，加入10 μL Annexin V，避光4 ℃ 孵育30 min，再加入100 μL binding buffer混匀后加入5 μL PI染液，避光4 ℃ 孵育5 min，流式细胞仪(FACSCalibur, Becton-Dickinson)进行检测，CellQuestTM软件 (Becton-Dickinson)进行分析。Annexin V+PI-标记为早期凋亡细胞，Annexin V+PI+标记为晚期凋亡以及坏死细胞，细胞相对凋亡率(%)=处理组凋亡率/正常组凋亡率×100%。

5细胞内ROS水平检测

细胞内ROS水平采用DCFH-DA荧光探针进行检测。取对数生长期的hFOB1.19细胞接种于100 mm培养皿中。在含10%FBS的培养基中培养24 h，加入FAC进行处理，羰酰氰基对氯苯脘(carbonyl cyanide-chlorophenylhydrazone，CCCP)作为阳性对照。使用无血清的培养基洗2次后，加入20 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育1 h，每5 min振荡细胞1次。用无血清培养基洗3次细胞后，流式细胞仪进行检测，CellQuestTM软件分析并计算ROS阳性率。

6Westernblotting检测MAPK途径相关蛋白

将培养的hFOB1.19细胞用预冷的PBS洗2次，刮落细胞后1 000 r/min 离心5 min；每组加入预冷的细胞裂解液，冰上放置30 min，超声细胞破碎仪破碎细胞。用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白含量。取适量样品，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用甲醇活化10 s后，在电转移架上恒流200 mA转移(90～120 min)。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h。Ⅰ抗按1∶400～1∶1 000进行稀释，4 ℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗(1∶5 000)封闭2 h后，用增强型化学免疫印迹检测系统(ECL)检测免疫反应蛋白。

7统计学处理

采用SPSS 17.1统计学软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1枸橼酸铁铵对hFOB1.19细胞增殖的抑制

枸橼酸铁铵对hFOB1.19细胞增殖有明显的抑制作用，并呈剂量效应关系，见图1。24、48和72 h的IC50分别为247 μmol/L、176 μmol/L和158 μmol/L。

Figure 1. Cell proliferation detected by MTT assay after FAC treatment.Mean±SD.n=3. The curves showed dose-effect relationship. The half maximal (50%) inhibitory concentrations were 247 μmol/L，176 μmol/L and 158 μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h, respectively.

图1MTT检测枸橼酸铁铵对hFOB1.19细胞增殖的影响

2构橼酸铁铵可显著提高hFOB1.19细胞内的ROS水平

不同浓度的枸橼酸铁铵作用于hFOB1.19细胞24 h后，ROS水平与对照组相比明显升高，荧光波峰向右迁移，呈浓度依赖性，见图2A。与正常组相比，不同浓度的枸橼酸铁铵作用于hFOB 1.19细胞24 h后，ROS阳性率明显增加(P<0.01),见图2B，分别由正常组的(8.34±1.30)%增加到FAC 100 μmol/L组的(35.73±2.52)%、FAC 300 μmol/L组的(62.89±4.24)%和FAC 500 μmol/L组的(76.06±3.55)%。加入抗氧化剂NAC后，ROS阳性率明显降低(P<0.01)，为(10.1±1.5)%，与正常组相比无明显差别。

3枸橼酸铁铵可以通过提高细胞内的ROS水平诱导hFOB1.19细胞凋亡

与正常组相比，不同浓度的枸橼酸铁铵作用于hFOB1.19细胞24 h后，细胞早期凋亡和总凋亡均明显增加(P<0.01)，早期凋亡分别由正常组的(5.03±1.09)%，增加到FAC 100 μmol/L组的(8.98±3.33)%、FAC 300 μmol/L组的(19.31±9.12)%和FAC 500 μmol/L组的(28.93±7.72)%。加入抗氧化剂NAC后，细胞早期凋亡和总凋亡率均降低(P<0.01)，与正常组比无明显差别，见图3。

4枸橼酸铁铵激活hFOB1.19细胞内的MAPK通路

与对照组相比，不同浓度枸橼酸铁铵作用hFOB1.19细胞24 h后，细胞内的p-ERK1/2、p-p38以及p-JNK表达明显增加(P<0.01)，见图4。加入抗氧化剂NAC后，细胞内的p-ERK1/2、p-p38以及p-JNK表达均降低(P<0.01)，与正常组比无明显差别。

Figure 2. FAC increased the ROS level in hFOB1.19 cells. The ROS level was measured by flow cytometry analysis in hFOB1.19 cells stained with DCFH-DA.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

图2枸橼酸铁铵显著提高hFOB1.19细胞内的ROS水平

讨 论

骨质疏松是血色素沉着病等疾病的重要并发症，同时，绝经后骨质疏松伴随着骨骼铁的沉积[2,4]，这些都说明了体内高铁与骨质疏松的相互关系，但高铁所引起骨质疏松的具体机制目前尚不清楚。

骨质疏松主要与骨吸收和骨形成的动态平衡破坏有关。其中骨的形成和吸收分别由成骨细胞和破骨细胞完成[5]。成骨细胞的数量和活性决定了骨形成水平。成骨细胞的凋亡可以导致成骨细胞数量减少，骨形成降低[6]。相关实验表明，高铁可以诱导多种细胞凋亡。本研究发现高浓度的枸橼酸铁铵可以引起成骨细胞活性的降低和成骨细胞凋亡的增加。

Figure 3. The apoptosis of hFOB1.19 cells detected by Annexin V/PI staining after FAC treatment.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

图3枸橼酸铁铵通过提高细胞内ROS水平诱导hFOB1.19细胞凋亡

Figure 4. The expression of the proteins in MAPK signaling pathways.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

图4枸橼酸铁铵激活hFOB1.19细胞内的MAPK通路

铁作为催化剂会产生大量的ROS[7-8]。本研究发现高浓度的枸橼酸铁铵可以引起hFOB1.19细胞内ROS水平的增加，而加入抗氧化剂后ROS的水平明显降低，并且细胞凋亡率明显减少，这说明了，高铁可以通过提高细胞内ROS水平，引起细胞内氧化应激，从而导致细胞凋亡。ROS是具有高度反应活性的基团，能够促进蛋白氧化，膜脂质过氧化以及核酸改变[9]。

ROS可以通过多种途径引起细胞凋亡[10-11]。其中MAPK级联通路是重要的调节通路[12]。细胞运用这一系统将胞外刺激信号转导到胞核，参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理病理过程[13]。其中ERK1/2、JNK和p38蛋白对胞内氧化应激状态很敏感[14-15]。我们发现高浓度枸橼酸铁铵作用成骨细胞24 h后，磷酸化的ERK1/2、JNK和p38明显增加，说明了高铁可以激活MAPK通路从而引起成骨细胞凋亡。而加入抗氧化剂NAC后，ERK1/2、JNK、p38蛋白的磷酸化明显减少，证明高铁所引起的MAPK通路的激活可能是由于ROS水平的升高所引起的。

综上所述，铁超载可以hFOB1.19细胞增加细胞内的ROS水平，并且激活氧化应激相关MAPK通路蛋白的表达，从而抑制细胞的增殖活性，诱导hFOB1.19细胞凋亡。

[1] Aisen P, Enns C, Wessling-Resnick M. Chemistry and biology of eukaryotic iron metabolism[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2001, 33(10): 940-959.

[2] Yamasaki K, Hagiwara H. Excess iron inhibits osteoblast metabolism[J]. Toxicol Lett, 2009, 191(2-3): 211-215.

[3] Doyard M, Fatih N, Monnier A, et al. Iron excess limitsHHIPL-2 gene expression and decreases osteoblastic activity in human MG-63 cells[J]. Osteoporos Int,2012, 23(10):2435-2445.

[4] Liu G, Men P, Kenner GH, et al. Age-associated iron accumulation in bone: implications for postmenopausal osteoporosis and a new target for prevention and treatment by chelation[J]. Biometals, 2006, 19(3): 245-251.

[5] Reeve J, Hesp R, Wootton R. A new tracer method for the calculation of rates of bone formation and breakdown in osteoporosis and other generalized skeletal disorders[J]. Calcif Tissue Res, 1976, 22(2):191-206.

[6] 郭宝磊，杨茂伟，梁 单，等. 高糖通过提高ROS水平和钙超载诱导小鼠MC3T3-E1成骨细胞凋亡[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(2):292-297.

[7] Galaris D, Pantopoulos K. Oxidative stress and iron homeostasis: mechanistic and health aspects[J]. Crit Rev Clin Lab Sci, 2008，45(1):1-23.

[8] Diesen DL, Kuo PC. Nitric oxide and redox regulation in the liver: part II. Redox biology in pathologic hepatocytes and implications for intervention[J]. J Surg Res, 2011，167(1):96-112.

[9] Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Vina J.Exercise and hormesis: activation of cellular antioxidant signaling pathway[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006，1067:425-435.

[10] 肖 骏，马 渝，邓松柏,等.芪苈强心对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2012,28(6):1045-1050.

[11] 李俐琳，任 姿，曾海涛，等.肥胖引起的线粒体功能及抗氧化异常促进小鼠卵母细胞排卵后老化[J].中国病理生理杂志，2012,28(10):1841-1846.

[12] Arimoto K, Fukuda H, Imajoh-Ohmi S, et al. Formation of stress granules inhibits apoptosis by suppressing stress-responsive MAPK pathways[J]. Nat Cell Biol, 2008，10(11):1324-1332.

[13] Radak Z, Zhao Z, Goto S, et al. Age-associated neurodegeneration and oxidative damage to lipids, proteins and DNA[J]. Mol Aspects Med, 2011, 32(4-6):305-315.

[14] Yuan H, Zhang X, Huang X, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species mediate FFAs-induced dysfunction and apoptosis of β-cells via JNK, p38 MAPK and p53 pathways[J]. PLoS One, 2010,5(12):e15726.

[15] Wang X, Liu JZ, Hu JX, et al. ROS-activated p38 MAPK/ERK-Akt cascade plays a central role in palmitic acid-stimulated hepatocyte proliferation[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(2):539-551.

OverloadofferricammoniumcitratetriggersMAPKpathwaysbyproducinghighlevelofreactiveoxygenspeciesandinducesapoptosisofhumanhFOB1.19osteoblastcells

CAO Jun-jun, YANG Mao-wei, GUO Bao-lei, LIANG Dan

(DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:ymw69@sohu.com)

AIM: To investigate the role of reative oxygen species (ROS) generated by iron overload in activating the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways and apoptosis.METHODSCultured human osteoblast cell line hFOB1.19 was treated with ferric ammonium citrate (FAC) at concentrations of 0～500 μmoL/L. The proliferation of hFOB1.19 cells was analyzed by MTT assay. Apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin V/PI staining. The expression levels of p-ERK, p-JNK and p-p38 were determined by Western blotting 24 h after treatment with FAC.RESULTSAfter treated with FAC, the cell proliferation was inhibited. The early apoptosis and total cell death were significantly increased. The levels of ROS were increased to (35.73±2.52)%, (62.89±4.24)% and (76.06±3.55)% with the increasing doses of FAC treatmen,respectively. The expression levels of p-ERK, p-JNK and p-p38 were also remarkably elevated in FAC groups.CONCLUSIONIron overload increases intracellular ROS level, thus triggering the MAPK pathways and inducing apoptosis of human hFOB1.19 osteoblast cells.

Iron; Osteoblast; Apoptosis; Reactive oxygen species; MAPK signaling pathways

R363.2+1

A

1000- 4718(2013)03- 0476- 05

2012- 08- 31

2013- 01- 22

国家自然科学基金资助项目(No. 81170808)

△通讯作者 Tel: 024-81359668; E-mail: ymw69@sohu.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.016