李茂生， 徐 敏， 张荣贵， 徐光勇， 张唯力

(重庆医科大学附属第二医院泌尿外科，重庆 400010)

雌激素通过调节转录因子STAT-1促进大鼠前列腺组织RANTES的表达及炎症反应

李茂生， 徐 敏， 张荣贵， 徐光勇， 张唯力△

(重庆医科大学附属第二医院泌尿外科，重庆 400010)

目的观察雌激素(E2)诱导的大鼠慢性非细菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)中信号转导子及转录激活子 1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT-1)的激活和调节活化正常T细胞表达及分泌因子(regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted，RANTES)的表达，探讨雌激素诱导炎症形成的机制。方法将80只老年雄性SD大鼠随机分为对照组、去势组、去势+E2组和去势+E2+AG490组，每组20只。苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠前列腺组织病理改变。Western blotting法测定STAT-1及p-STAT-1蛋白水平。RT-PCR和免疫组化SP法分别检测RANTES mRNA和蛋白表达水平，并分析p-STAT-1与RANTES表达水平的相关性。结果去势+E2组前列腺组织呈明显炎症表现。去势+E2组中STAT-1及p-STAT-1蛋白表达明显高于对照组及去势组(P<0.01)，RANTES mRNA和蛋白表达也显著增高(P<0.01)。去势+E2+AG490组中STAT-1及p-STAT-1蛋白、RANTES mRNA和蛋白表达水平较去势+E2组明显降低(P<0.01)。大鼠前列腺组织中p-STAT-1表达水平与RANTES mRNA转录水平呈正相关(r=0.735，P<0.05)，RANTES表达水平与RANTES mRNA转录水平亦呈正相关(r=0.694，P<0.05)。结论雌激素诱导CNP的形成可能与调节转录因子STAT-1、促进RANTES分子的表达及炎症反应有关。

雌激素； 信号转导子及转录激活子 1； 调节活化正常T细胞表达及分泌因子； 前列腺炎

慢性非细菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis,CNP)是临床常见的泌尿生殖系统疾病。近年来研究发现雌激素水平的增加可以引起CNP的形成，且被证实这种由于激素水平的不平衡而引起的前列腺炎是一种自身免疫性疾病[1]。CNP时白细胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)等炎症因子的变化[2-3]，也提示自身免疫反应可能与CNP的发病有关。信号转导子及转录激活子 1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT-1)是介导免疫、炎症、细胞增生的一种细胞信号转录因子，它的活化在一些有自身免疫因素参与的疾病如类风湿关节炎、狼疮、哮喘等的病理生理过程中起重要作用。调节活化T细胞表达及分泌因子(regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted,RANTES)作为一种受STAT-1调节的特异性β-趋化因子，它在免疫炎症的形成、发展及病理损害中发挥重要作用。本研究将通过雌激素诱导建立大鼠CNP模型，测定大鼠前列腺组织中STAT-1蛋白的磷酸化水平和RANTES分子的基因及蛋白表达水平，并应用STAT-1信号通路特异性阻断剂——α-氰-3,4-二羟基-N-苄基肉桂酰胺(AG490)阻断STAT-1信号通路研究雌激素对RANTES分子影响，从而探讨雌激素诱导CNP形成的可能机制。

材 料 与 方 法

1研究对象及处理

清洁级老年雄性SD大鼠，体重为(550±50)g，80只(重庆医科大学实验动物中心提供)，SPF级环境，适应性饲养1周。将大鼠随机分为对照组、去势组、去势+苯甲酸雌二醇(17β-estradiol benzoate,E2)组和去势+E2+AG490组，每组20只。采用魏武然等[4]的方法建立大鼠前列腺炎模型，E2用大豆油稀释，AG490用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)稀释，具体处理方案见表1。

表1 各组大鼠的处理方案

E2:17β-estradiol benzoate;DMSO:dimethyl sulfoxide; sc:subcutaneous injection; ip:intraperitoneal injection.

2药物试剂及方法

2.1药物与主要试剂 苯甲酸雌二醇(批号为1007071，天津金耀)，AG490(编号为S1509，碧云天)，STAT-1和p-STAT-1抗体(Cell signal)，β-actin抗体(北京四正柏)，山羊抗兔、抗小鼠Ⅱ抗(北京联科)，反转录试剂盒及扩增试剂盒(TaKaRa)，RANTES抗体(武汉博士德)，免疫组化SP试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(北京中杉)。

2.2HE染色及免疫组化 4 μm石蜡标本切片。一部分切片HE染色后行组织病理学评估，如果在显微镜视野下观察到炎症细胞浸润则被视为前列腺炎阳性，采用Bernoulli等[5]方法对大鼠前列腺组织炎症行病理学分级，根据其炎症细胞的浸润范围分为3级：Ⅰ级：血管周围的(炎症细胞紧紧地围绕在毛细血管周围)；Ⅱ级：间质和腺周的(炎症细胞浸润到间质和上皮组织内)；Ⅲ级：腺腔内的(炎症细胞浸润到腺腔)。另一部分切片行组织化学染色，采用免疫组化SP法，按照试剂盒说明书操作，抗RANTES抗体(1∶150)，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，树脂封片。以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。

2.3RT-PCR 提取Total RNA，按照TaKaRa公司反转录及扩增试剂盒说明书操作，RANTES引物，正义链5’-CATCCCTCACCGTCATCCTC-3’，反义链5’-CTTGAACCCACTTCTTCTCTGG-3’，产物大小231 bp；内参照β-actin引物,正义链5’-CCTGAAGTACCCCATTGAACAC-3’，反义链5’-CTCATTGCCGATAGTGATGACC-3’，产物大小562 bp，凝胶电泳，成像。

2.4Western blotting 提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，抗STAT-1(1∶3 000)、p-STAT-1(1∶1 000)和β-actin(1∶6 000) Ⅰ 抗4 ℃孵育过夜，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(1∶6 000)、山羊抗小鼠(1∶5 000)Ⅱ抗室温孵育1 h，碱性磷酸酶显色，ECL发光成像。

3图像分析与统计学处理

免疫组化染色平均吸光度分析采用Image-Pro Plus 6.0软件，Western blotting和RT-PCR灰度分析采用Bio-Rad凝胶成像系统的Quantity One软件。应用SPSS 19.0软件统计分析，各组数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1组织形态的观察

在对照组，大鼠前列腺的间质及上皮组织无明显炎症细胞浸润。在去势组中，9只大鼠前列腺组织未见明显炎症细胞浸润，10只病理分级达Ⅰ级，1只达Ⅱ级。去势+E2组大鼠前列腺组织增生或萎缩，腺腔极不规则，细胞排列紊乱，间质和腺腔可见广泛分布的炎症细胞，表明CNP的形成，在该组20只大鼠中，11只病理表现为Ⅱ级，9只表现为Ⅲ级。与去势+E2组比较，去势+E2+AG490组却只能在大鼠前列腺间质和腺周见到少量炎症细胞浸润，其中15只病理表现为Ⅰ级，5只为Ⅱ级，见图1。

Figure 1. HE staining of rat prostatetissues in various groups (×200).A:control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group.

图1各组大鼠前列腺组织HE染色

2STAT-1和p-STAT-1蛋白的Westernblotting检测结果

对照组STAT-1和p-STAT-1蛋白的表达较弱。去势组2种蛋白表达趋势稍有增加。去势+E2组STAT-1和p-STAT-1蛋白的表达水平明显增高，其差异较对照组及去势组均有统计学意义(P<0.01)。去势+E2+AG490组2种蛋白表达较去势+E2组均明显减少(P<0.01)，较对照组也有显著差异(P<0.01)，见图2、表2。

Figure 2. Western blotting results of STAT-1 and p-STAT-1 proteins.A: control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group.

图2STAT-1及p-STAT-1蛋白的Wesrternblotting结果

表2各组大鼠前列腺组织STAT-1和p-STAT-1的表达

Table 2. Expression of STAT-1 and p-STAT-1 in rat prostate tissues in various groups(mean±SD.n=20)

GroupSTAT⁃1p⁃STAT⁃1Control0．306±0．0240．035±0．003Castration0．312±0．0100．046±0．012E2+castration0．521±0．008∗∗△△0．189±0．006∗∗△△E2+AG490+castration0．387±0．012∗∗▲▲0．016±0．005∗∗▲▲

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vscastration group;▲▲P<0.01vsE2+castration group.

3RANTES的RT-PCR和免疫组化检测结果

对照组RANTES mRNA的表达水平较低，RANTES蛋白染色阴性。去势组RANTES mRNA及蛋白表达水平较对照组略有增高。去势+E2组RANTES mRNA的表达水平明显增高，RANTES蛋白染色强阳性，其差异较对照组及去势组均有统计学意义(P<0.01)。去势+E2+AG490组RANTES mRNA的表达水平较去势+E2组明显降低，RANTES蛋白染色弱阳性，其差异有统计学意义(P<0.01)，与对照组比较，其差异仍有统计学意义(P<0.01)。为排除非特异性着色产生的假阳性结果，每次染色均做空白对照，其结果均为阴性，见图3、4和表3。

4相关性分析

在CNP大鼠的前列腺组织中，p-STAT-1蛋白表达水平与RANTES mRNA转录水平呈正相关(r=0.735，P<0.05)，RANTES蛋白表达水平与RANTES mRNA转录水平亦呈正相关(r=0.694，P<0.05)。

讨 论

近年来，研究发现人体内雌激素水平的改变与CNP的发生发展有着密切关系，在慢性非细菌性前列腺炎病人的血清和前列腺液中雌激素水平明显增高[6-7]，雌激素水平的变化是如何影响前列腺炎症的形成却尚不清楚，激素诱导炎症性动物模型的发展为我们研究这一机制提供了一个可行的方法。研究表明雌激素诱导的CNP动物模型的组织形态及病理变化与临床慢性非细菌性前列腺炎接近，常被用于CNP发病机制及药物评价等方面的研究[8-9]。本研究通过雌激素诱导获得大鼠CNP模型，观察到前列腺组织增生或萎缩，腺腔不规则，细胞排列紊乱，可见假复层表现，腺泡腔及间质可见炎症细胞浸润等典型的前列腺炎病理表现，与人类CNP病理近似。我们还发现这种由于雌激素水平的变化而引起的炎症中伴随着明显的STAT-1分子的激活和RANTES分子表达水平的增加，应用特异性阻断剂AG490处理后，STAT-1分子的激活被显著抑制，同时RANTES 表达水平明显降低。

Figure 3. RT-PCR results of RANTES mRNA.A: control group;B: castration group;C: E2+castration group;D: E2+AG490+castration group;M: DNA marker.

图3RANTESmRNA的RT-PCR结果

Figure 4. RANTES immunostaining of rat prostate tissues in various groups (×200).A： RANTES negative in control group;B: RANTES weakly positive in castration group;C: RANTES strongly positive in E2+castration group;D: RANTES weakly positive in E2+AG490+castration group.Red arrows:immunopositive cells.

图4各组大鼠前列腺组织RANTES的免疫染色

表3各组大鼠前列腺RANTESmRNA的表达和RANTES的免疫组化图像结果分析

Table 3. Expression of RANTES mRNA and immunohistological staining of RANTES in rat prostate tissues in various groups(mean±SD.n=20)

GroupRANTESmRNARANTESproteinControl0．399±0．0040Castration0．557±0．0080．188±0．016E2+castration0．855±0．027∗∗△△0．658±0．047∗∗△△E2+AG490+castration0．483±0．013∗∗▲▲0．197±0．029∗∗▲▲

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vscastration group;▲▲P<0.01vsE2+castration group.

转录因子 STAT-1是Janus激酶/信号转导子及转录激活子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STATs)信号途径重要组成部分，JAK/STATs信号转导通路同丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路共同组成细胞内3条重要的炎症信号通路[10]，广泛参与了细胞一系列生理及病理反应过程，而STATs酪氨酸磷酸化则是其调节转录发挥多种生物学效应的关键环节[11]。其中JAK/STAT-1信号通路在调节细胞增殖、分化和机体炎症、免疫等方面发挥重要作用[12]。AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，其主要作用是选择性拮抗JAK2酪氨酸激酶磷酸化，可有效阻断其下游信号转录而抑制细胞因子的生理和病理效应。研究表明CNP组织中细胞间黏附分子1(intercellular adyesion molecule 1，ICAM-1)、IFN-γ等细胞因子的水平显著升高，在CNP的发病过程中发挥重要作用，而上述细胞因子均可通过STAT-1信号通路发挥作用[13]，因此我们推测STAT-1信号通路参与了CNP的发病。本研究利用Wes-tern blotting的方法发现去势+E2组大鼠的前列腺组织中总蛋白STAT-1和磷酸化蛋白p-STAT-1的表达较对照组均显著增强，而在去势组中，尽管STAT-1也有激活，但与去势+E2组相比其仍具有显著差异，提示雌激素能够增强转录因子STAT-1的磷酸化和总蛋白的表达。在应用其特异性阻断剂AG490处理后，我们发现STAT-1及p-STAT-1蛋白表达较去势+E2组减少，且病理观察显示炎症有所减轻，证实转录因子STAT-1确实参与了雌激素诱导CNP的形成过程，并在其中发挥着重要作用。

RANTES是β-趋化因子中的一员，能促进白细胞向炎症部位的迁移和浸润，介导淋巴细胞的迁移和归巢。除对T细胞和巨噬细胞有较特异的趋化作用外，还对T 细胞及巨噬细胞有强大的激活功能，能诱导多种炎症因子如IL-1β、TNF-α、ICAM-1等大量表达，这些炎症因子在CNP中均有报道[2,9]。本研究中无论是与对照组还是去势组相比较，均可观察到去势+E2组大鼠的前列腺组织中RANTES mRNA转录水平明显增强且伴随着RANTES蛋白表达的增多，表明趋化因子RANTES参与了雌激素诱导大鼠CNP的形成过程。

RANTES的表达有赖于转录因子STAT-1的调节。近来研究STAT-1α基因敲除的小鼠揭示，STAT-1α的活化是IFN-γ诱导干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IFR1) mRNA表达的必要条件，IRF1可与RANTES启动子结合，而这是RANTES启动子活化所必不可少的[14]。郝杰等[15]在利用β淀粉样蛋白诱导人神经胶质瘤细胞(U251)炎性反应时发现细胞趋化因子RANTES的产生与STAT-1的活化有关。本研究相关分析表明：STAT-1的磷酸化水平与RANTES mRNA的转录水平呈正相关，RANTES的转录水平和翻译水平亦呈正相关，且STAT-1信号通路在受到AG490的阻断时，RANTES的表达也明显减少，从而进一步证实了RANTES的表达受STAT-1信号通路的调节。

综上所述，在CNP中，转录因子STAT-1被显著激活，趋化因子RANTES表达水平也显著增强，且STAT-1蛋白的激活与RANTES的表达有着相同的趋势，所以我们推测雌激素引起大鼠CNP的可能机制，即：雌激素水平的变化导致STAT-1信号通路被激活，从而上调下游RANTES的转录水平，引起RANTES蛋白的表达增加，过表达的RANTES进一步促进了白细胞向炎症部位的迁移和浸润，同时激活T 细胞及巨噬细胞诱导产生多种炎症因子，加重前列腺组织中的炎症过程，最终导致慢性非细菌性前列腺炎的形成。但雌激素是如何激活STAT-1信号通路有待进一步深入研究。同时，我们在应用其特异性阻断剂AG490时发现，趋化因子RANTES的表达有着明显减少且炎症有着不同程度的减轻，提示我们在临床研究治疗慢性非细菌性前列腺炎方面有了一个新的靶点。

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EstrogenregulatestranscriptionfactorSTAT-1topromoteRANTESexpressionandinflammatoryresponseinratprostate

LI Mao-sheng, XU Min, ZHANG Rong-gui, XU Guang-yong, ZHANG Wei-li

(DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail: 66zwl@sina.com)

AIM: To observe the activation of signal transducer and activator of transcription 1(STAT-1) and the expression of regulated on activation, normal T-cell expression and secreted (RANTES) in rat model of chronic nonbacteria prostatitis induced by estrogen (E2).METHODSEighty aged male rats were randomized into control group, castration group, E2+castration group and E2+AG490+castration group. The pathological changes of the prostate tissues in the rats were observed under microscope with HE staining. The protein expression of STAT-1 and p-STAT-1 in rat prostate tissues was examined by Western blotting. The expression of RANTES at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and immunohistochemistry. The correlation between p-STAT-1 and RANTES was also analyzed.RESULTSObvious inflammatory reactions were found in E2+castration group. STAT-1 protein was in activated state and the expression of RANTES at mRNA and protein levels increased in E2+castration group as compared with control group and castration group. On the contrary, the phosphorylation of STAT-1 protein was markedly suppressed, and the mRNA and protein expression of RANTES in E2+AG490+castration group was notably lower than those in E2+castration group. There was a positive correlation between the activation of STAT-1 protein and the mRNA level of RANTES (r=0.735,P<0.05), and a positive correlation of RANTES expression between mRNA and protein levels was also observed (r=0.694,P<0.05).CONCLUSIONThe promotive effects of transcription factor STAT-1 on RANTES expression and inflammatory response may be involved in the molecular mechanism of estrogen-induced chronic nonbacterial prostatitis.

Estrogen; Signal transducer and activator of transcription 1; Regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted; Prostatitis

R697+.33

A

1000- 4718(2013)03- 0521- 05

2012- 08- 12

2013- 01- 04

△通讯作者 Tel：023-63693574；E-mail：66zwl@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.024