薛育政 吴燕敏 吴铁龙 盛颖玥 余利华 曹海燕 杨睛 林刚 陆宇峰 刘宗良 俞宪民 李兆申

5-HT及5-HT2A受体在大鼠急性坏死性胰腺炎肠功能障碍时的表达及机制研究

薛育政 吴燕敏 吴铁龙 盛颖玥 余利华 曹海燕 杨睛 林刚 陆宇峰 刘宗良 俞宪民 李兆申

人体中约90% 5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)存在于胃肠道，其余存在于血小板及中枢神经系统。最近研究表明，摄入的食物到达十二指肠时不仅能刺激胆囊收缩素(CCK)的释放，同时刺激肠嗜铬细胞释放5-HT。5-HT的释放又反射性激活迷走神经传入纤维上的相应受体，进而激活肠反射通路，引起肠蠕动增快[1-2]。近年来，5-HT2A受体(5-HT2AR)和5-HT2B受体(5-HT2BR)对胃肠运动的影响越来越受到人们关注。Bertoni等[3]用5-HT2A激活剂成功制造了肠系膜缺血-再灌注损伤小鼠模型，并证实了肠系膜缺血-再灌注损伤可以造成胃肠运动的减弱。

胃肠功能障碍是重症急性胰腺炎(SAP)常见的并发症。目前对5-HT及其受体在SAP胃肠功能障碍中的变化及作用机制鲜有报道。本研究检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠血5-HT含量及肠黏膜中5-HT2AR的表达，探讨5-HT及5-HT2AR在ANP肠功能障碍中的作用及可能机制。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：SPF级雄性SD大鼠36只，体重(200±20)g，由南通大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏，2002-0022)。按完全随机法将大鼠分为ANP组和假手术组，每组18只。根据文献[4]，采用胆胰管内注入3.5%牛磺胆酸钠0.1 ml/100 g体重(Sigma公司)的方法制备ANP模型。假手术组大鼠开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次后关腹。术后3、6、12 h分批处死6只大鼠。

2．血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量测定：取血分离血清。全自动生化分析仪检测血淀粉酶、脂肪酶水平， ELISA法测定血5-HT、IL-6含量。

3．小肠推进率测定：制模后2.5 h用含苯酚红2 mg/ml的生理盐水1.0 ml给大鼠灌胃，30 min后快速剖腹取出小肠。剪下幽门远端至阑尾近端的肠管，铺在纸上，不加任何拖曳牵引，测小肠全长和苯酚红前沿至幽门远端的距离。若苯酚红前沿显示不清楚，可在疑似处剪开小肠，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液确认(显示鲜亮的玫红色)，并需在其前和后各1 cm处再次滴加NaOH溶液验证，以保证数据的准确性。小肠推进率为苯酚红推进的小肠长度/小肠全长×100%。

4．肠黏膜5-HT2AR蛋白表达检测：取6 h点大鼠距屈氏韧带10 cm的空肠、末端回肠及乙状结肠组织(约50 mg)，常规提取总蛋白后行蛋白质印迹法检测5-HT2AR蛋白，以β-actin作为内参。兔抗大鼠5-HT2AR多克隆抗体工作浓度1∶400，羊抗兔Ig-HRP工作浓度1∶500，最后，ECL发光，X线曝光、显影、定影。

5．肠黏膜5-HT2A蛋白表达检测：取3、6、12 h点大鼠距屈氏韧带10 cm的空肠、末端回肠及乙状结肠组织约5 mm×5 mm大小，常规固定、石蜡包埋、切片，行免疫组化法检测5-HT2A蛋白表达。抗5-HT2A一抗工作浓度1∶300，辣根过氧化物酶标记的二抗工作浓度1∶500，最后DAB显色，复染、脱水、封片。胞质呈棕色染色为阳性细胞。每张切片选择5个高倍镜视野，应用Leica RX250型图像分析系统进行定量灰度扫描，Qwin软件分析，自动计算5-HT2A阳性细胞面积，取均值。

6．胰腺组织病理学检查：胰腺组织经HE染色后由两位专业的病理医师双盲阅片。每组随机取3张切片，每张切片随机选取10个高倍视野，从水肿、感染、出血和坏死4个方面评价胰腺组织损伤的程度。

二、结果

1．大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量变化：ANP组大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量均较同时间点假手术组大鼠显著升高，差异有统计学意义(P值均<0.05，表1)。

表1 两组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量变化

注：与假手术同时点组比较，aP<0.05

2．大鼠胰腺组织病理学改变：假手术组大鼠胰腺表现为部分间质水肿，少量炎性细胞浸润，偶可见点状出血，极少量腺泡细胞坏死。ANP组大鼠3 h时可有明显的小叶间水肿，散在片状出血，较多炎性细胞浸润，部分腺泡细胞变性坏死；6、12 h可见大量炎性细胞浸润，多处片状出血，小叶结构破坏，大量腺泡细胞坏死(图1)。

图13、6、12 h点(a、b、c)假手术组(上)及ANP组(下)胰腺病理变化(HE ×400)

3．大鼠小肠推进率：ANP组大鼠3 h时的小肠推进率为(24.78±4.25)%，假手术组大鼠为(61.54±9.01)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

4．大鼠肠黏膜中5-HT2AR蛋白的表达：ANP组大鼠6 h时空肠、末端回肠及乙状结肠黏膜5-HT2AR蛋白表达水平均较假手术组显著增强(图2)。

图2假手术组6 h点大鼠空肠(a)、末端回肠(b)、乙状结肠(c)及ANP组6 h点大鼠空肠(d)、末端回肠(e)、乙状结肠(f)黏膜中5-HT2AR蛋白的表达

5．大鼠肠黏膜中5-HT2A蛋白表达：ANP组大鼠3、6、12 h空肠5-HT2A阳性细胞面积分别为(4.85±0.53)、(5.04±0.61)、(4.79±0.56)万μm2，较假手术组大鼠的(3.46±0.35)、(3.78±0.47)、(3.86±0.43)万μm2均显著增多；ANP组末端回肠5-HT2A阳性细胞面积分别为(4.91±0.61)、(4.79±0.53)、(5.16±0.73)万μm2，较假手术组的(3.67±0.45)、(3.78±0.48)、(3.53±0.38)万μm2均显著增多；ANP组乙状结肠5-HT2A阳性细胞面积分别为(4.79±0.69)、(4.83±0.74)、(4.94±0.82)万μm2，较假手术组的(3.65±0.44) 、(3.79±0.51)、(3.87±0.59)万μm2均显著增多，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图3、4、5)。

图33、6、12 h点(a、b、c)假手术组(上)及ANP组(下)空肠黏膜中5-HT2A阳性细胞(免疫组化 ×400)

图43、6、12 h点(a、b、c)假手术组(上)及ANP组(下)回肠黏膜中5-HT2A阳性细胞(免疫组化 ×400)

图53、6、12 h点(a、b、c)假手术组(上)及ANP组(下)乙状结肠黏膜中5-HT2A阳性细胞(免疫组化 ×400)

讨论肠功能障碍是SAP最常见的并发症之一，主要表现为肠动力减弱、肠黏膜缺血再灌注性损伤及继发性肠黏膜通透性增加[5]，一旦发生肠功能障碍，可进一步引起肠源性感染甚至多脏器功能衰竭，最终导致SAP患者病死率增加。临床发现，及时有效治疗SAP患者继发的肠道功能障碍，可有效降低SAP患者并发症的发生率及病死率。

夏敏等[6]研究发现，血清中IL-6的水平与急性胰腺炎病情严重程度及并发症的发生率呈显著正相关。Ito等[7]研究证实，5-HT2AR的激活能增加5-HT诱导平滑肌细胞产生IL-6。本研究结果显示，ANP组大鼠血清5-HT、IL-6水平较假手术组明显升高，且随时间的延长而增加；空肠、末端回肠及乙状结肠黏膜5-HT2AR及5-HT2A蛋白表达均较假手术组显著增加，提示肠黏膜组织中5-HT2AR的激活能反射性地引起血清5-HT浓度增加，而血清5-HT的增加可提高血管通透性和促进内皮细胞产生嗜中性粒细胞趋化作用[8-9]，导致继发性肠黏膜通透性增加及肠黏膜缺血再灌注性损伤，这可能是ANP发生肠功能障碍的机制之一。

[1] Gershon MD. Nerves, reflexes, and the enteric nervous system: pathogenesis of the irritable bowel syndrome. J Clin Gastroenterol, 2005, 39: S184-S193.

[2] Owyang C, Logsdon CD. New insights into neurohormonal regulation of pancreatic secretion. Gastroenterology, 2004, 127: 957-969.

[3] Bertoni S, Ghizzardi P, Cattaruzza F, et al. Evidence for the involvement of 5-HT2Areceptors in mild mesenteric ischemia/reperfusion dysfunctions in mice. Pharmacol Res, 2007, 56 : 550-555.

[4] 薛育政, 刘宗良, 俞宪民,等. 还原型谷胱甘肽对实验性急性坏死性胰腺炎的治疗效果及机制.胰腺病学, 2007, 7: 212-215.

[5] 杨朝晖. 全身炎症反应综合征与急性胰腺炎病情的相关分析. 中华消化杂志, 2006, 26: 196-197．

[6] 夏敏，沈美琴，陈卫昌.血清促炎细胞因子水平与急性胰腺炎严重程度的相关性研究.中华消化杂志，2011,31:401-404.

[7] Ito T, Ikeda U, Shimpo M, et al. Serotonin increases interleukin-6 synthesis in human vascular smooth muscle cells. Circulation, 2000, 102 : 2522-2527.

[8] Fujie E, Irie K, Uchida Y, et al. Possible role of nitric oxide in 5-hydroxytryptamine-induced increase in vascular permeability in mouse skin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1994, 350:361-364.

[9] Charles A, Rounds S, Farber HW. Neutrophil chemoattractant production by cultured serotonin-stimulated bovine and human endothelial cells. Am J Physiol, 1991, 261:L133-L139.

2013-02-04)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.015

江苏省“333工程”科研项目(CAE01101-06)；江苏省中医药局中医药科技项目(LZ11127)；无锡巿社会发展项目(CSZ00N1110)

214041，无锡，无锡巿第三人民医院消化内科(薛育政、吴燕敏、吴铁龙、盛颖玥、余利华、曹海燕、杨睛、林刚、陆宇峰、刘宗良、俞宪民)；第二军医大学长海医院消化内科(李兆申)

李兆申，Email：zhaoshenli666@126.com