孙学成 余震 吴明 朱启槐

·短篇论著·

骨髓间充质干细胞对急性胰腺炎大鼠腹腔巨噬细胞活化的影响

孙学成 余震 吴明 朱启槐

巨噬细胞为主的多种免疫细胞共同参与重症急性胰腺炎(SAP)中炎症反应的级联样放大，构成了全身炎症反应综合征的免疫紊乱基础[1-2]。有研究报道，腹膜巨噬细胞、肺泡巨噬细胞和肝脏库弗细胞在实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)的不同阶段被活化[3-4]。骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种有多向分化能力的干细胞，具有向肠黏膜细胞分化的潜能，有可能作为肠黏膜损伤后的修复细胞[5]。但国内外实验研究结果均提示异体干细胞向肠黏膜迁移的数量极少，不足以有效修复受损的肠黏膜。本研究前期工作中发现腹腔内给予MSCs同样可以减轻肠黏膜损伤。本研究进一步探讨MSCs保护ANP时肠黏膜损伤的机制。

一、材料与方法

1．MSCs分离、培养及鉴定：成年健康清洁级SD大鼠(Sino-British SIPPR/BK)，鼠龄8～10周，体重200～250 g，购于第二军医大学动物实验中心。取1只大鼠，皮肤消毒后分离大鼠双侧股骨，用10%胎牛血清冲洗髓腔后，以800 r/min离心5 min，弃上清，按5×105/cm2的密度接种于含10%胎牛血清的DMEM+F12培养基中培养24 h，待细胞80%融合时传代3次，胰酶消化，收获细胞 (图1)。采用流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45进行鉴定。

2．动物模型制备及分组：取24只雌性大鼠，按数字表法随机分成对照组、ANP组和MSCs组。采用逆行胰胆管注射3%牛磺胆酸钠(Sigma公司)的方法制备ANP模型。MSCs组于ANP成模后12 h尾静脉注射MSCs 5×106个/只，连续3 d；ANP组尾静脉注射等容积生理盐水；对照组仅腹腔注射等容积生理盐水。术后72 h用乙醚吸入麻醉大鼠，下腹部皮肤消毒后腹腔注射无血清DMEM培养液10 ml，轻柔大鼠腹部2～3 min，静置5～7 min，用注射器吸取腹腔灌洗液。然后处死大鼠，取回肠组织。

3．大鼠腹腔巨噬细胞(PMs)分离、培养：取对照组大鼠的腹腔灌洗液，1000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2遍，再用含10%胎牛血清的DMEM的培养液调节细胞密度至1×106/ml接种于培养瓶，常规培养12 h，用无血清DMEM培养液漂洗2遍后加含10%胎牛血清的RPMI-1640的培养液继续培养，行台盼蓝和瑞氏染色进行鉴定(图2)。收获的大鼠PMs以l×106/ml的细胞密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后更换新培养基，分为常规培养液组(对照组)、常规培养液+ANP大鼠腹腔灌洗液组(灌洗液组)、常规培养液+ANP大鼠腹腔灌洗液+MSCs组(MSCs组)，加ANP大鼠腹腔灌洗液培养1 h后再加1×106/ml的MSCs)。常规培养18 h后收集培养上清液。

图1 MSCs细胞(×400) 图2 腹腔巨噬细胞(×400)

4．腹腔灌洗液和PMs培养上清液中TNFα、IL-1β和MIP-1α浓度测定：大鼠TNFα、IL-1β和 MIP-1α采用ELISA法检测，试剂盒均购自R&D公司，按说明书操作。

5．回肠组织病理学检查：取术后72 h各组大鼠回肠组织快速冷冻切片、丙酮固定、HE染色，由病理科医师按照Chiru标准行病理学评分。Chiru评分标准：正常小肠黏膜绒毛为0级；上皮下腔隙扩大、血管充血为1级；上皮下腔隙扩大明显、上皮与固有层分离为2级；上皮剥脱为3级；上皮剥脱显著为4级；固有层分解、出血、溃疡为5级。

6．回肠组织TNF-α、IL-1β mRNA表达检测：用Trizol抽提组织总RNA。采用RT-PCR法检测TNF-α、IL-1β mRNA。IL-1β引物上游AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT，下游TGAGTGACACTGCCTTCCTG，产物230 bp；TNF-α引物上游ACTCCCAGAAAAGCAAGCAA，下游CGAGCAGGAATGAGAAGA-GG，产物211 bp；内参β-actin引物上游CCTGTACGCCAACACAGTGC，下游ATACTCCTGCTTGCTGATCC，产物211 bp。引物均由上海英俊生物公司合成。PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 40 s、58℃(IL-1β)或60℃(TNF-α及β-actinin)40 s、72℃ 1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。

二、结果

1．大鼠腹腔灌洗液TNF-α、IL-1β和MIP-1α浓度的变化：对照组、ANP组、MSCs组腹腔灌洗液TNF-α浓度分别为(47.08±5.47)、(173.95±13.13)、(117.15±10.36)pg/ml；IL-1β浓度分别为(35.45±7.98)、(162.08±11.29)、(103.61±10.66)pg/ml；MIP-1α浓度分别为(4.83±0.48)、(57.01±5.16)、(20.02±3.04)pg/ml。ANP组均较对照组明显升高(F值分别为4.59，1.38，8.83，P值均<0.05)，MSCs组较ANP组明显下降(F值分别为39.9，65.7，40.2，P值均<0.05)，但仍明显高于对照组(F值分别为182.2，109.9，94.4，P值均<0.05)。

2．巨噬细胞培养上清液TNF-α、IL-1β和MIP-1α浓度的变化：对照组、灌洗液组、MSCs组的PMs培养上清中TNF-α浓度分别为(53.85±6.35)、(152.48±16.4)、(108.54±10.91)pg/ml；IL-1β浓度分别为(41.74±7.01)、(145.51±14.46)、(94.39±8.76)pg/ml；MIP-1α浓度分别为(5.53±0.80)、(49.36±6.63)、(16.91±2.84)pg/ml。灌洗液组较对照组明显升高(F值分别为154.2，178.4，222.5，P值均<0.05)；MSCs组较灌洗液组明显减少(F值分别为94.4，110.1，70.4，P值均<0.05)。

3．回肠组织病理改变：对照组大鼠肠道黏膜仅有轻度水肿及少量炎性细胞。ANP组可见肠黏膜绒毛上皮细胞脱落、毛细血管塌陷及大量的中性粒细胞浸润。MSCs组肠道组织损伤较ANP组减轻。3组病理评分为(3.88±0.22 )、(2.62±0.47)及(0.63±0.46)分，两两比较，差异均具有统计学意义(F值分别为5.7，49.1，27.6，P值均<0.05)。

4．大鼠回肠组织TNF-α、IL-1β mRNA表达水平的变化：ANP组和MSCs组回肠组织中TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的相对表达量均较对照组明显增强(3.53±0.69、1.87±0.38对0.49±0.12；4.71±1.09、2.24±0.25对1.10±0.21；F值分别为109.4，97.5，P值均<0.05)；MSCs组中二者的相对表达量较ANP组明显下降，差异有统计学意义(F值分别为11.9，87.0，P值均<0.05)。

讨论巨噬细胞处于天然免疫系统的最前线，具有良好的可塑性[6]。参与ANP时炎症反应的巨噬细胞包括肺泡巨噬细胞、库否细胞和腹腔巨噬细胞等，这些细胞过度活化使胰腺炎症放大，进而引起多器官功能衰竭。Lundberg等[7]和Jaffray等[8]分别将受损胰腺释放物、胰酶(如胰蛋白酶、弹性蛋白酶脂肪酶等)与巨噬细胞共培养，结果发现以上物质可以通过巨噬细胞上的膜结合受体促进IκB降解，激活NF-κB途径介导巨噬细胞活化，分泌促炎细胞因子。本研究结果显示，ANP大鼠腹腔灌洗液中TNP-α、IL-1β水平明显升高，作为促炎症细胞聚集的重要趋化因子MIP-1α的水平也明显升高，在体外用ANP大鼠腹腔灌洗上清液可以诱导PMs过度活化并分泌大量的促炎细胞因子，加重肠道病理损伤，且回肠内TNF-α、IL-1β mRNA的表达明显增强，表明过度活化的腹腔巨噬细胞是决定炎症轻重的核心细胞，并参与肠黏膜损伤。

MSCs可通过不同机制对多个脏器如心肌、神经和肾脏损伤具有修复作用[9-10]，但外源性干细胞的数量相对机体细胞量来说极少，而能迁移至受损脏器的干细胞数量更少，不足以弥补受损的细胞。文献报道[11-12]，MSCs可以通过旁分泌的方式而发挥一系列的生理学作用如抗炎、抗凋亡及促进血管形成等。本研究结果显示，无论是静脉给予还是腹腔给予MSCs均能减轻ANP后大鼠的细胞因子水平，减轻肠道黏膜的损伤。下调回肠黏膜TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的表达，提示异体MSCs对ANP时肠黏膜损伤具有保护作用。

MSCs可抑制多种免疫细胞(如T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞及树突状细胞)的活化、增殖和发育[13-15]。本研究采用加入ANP大鼠的腹腔灌洗液及异体MSCs的培养液培养PMs，结果细胞培养上清液中促炎细胞因子的含量减少，提示MSCs是通过抑制活化的PMs分泌促炎细胞因子，从而减轻肠黏膜损伤的。

[1] Gea-Sorli S, Guillamat R,Closa D, et al. Activation of lung macrophage subpopulations in experimental acute pancreatitis. J Pathol,2011, 223: 417-424.

[2] Gea-Sorli S, Closa D.Role of macrophage in the progression of acute pancreatitis.World J Gastrointest Pharmacol Ther, 2002, 132: 86-92.

[3] Satoh A, Shimosegawa T,Kimura K, et al. Nitric oxide is overproduced by peritoneal macrophages in rat taurocholate pancreatitis: the mechanism of inducible nitric oxide synthase expression. Pancreas, 1998, 17: 402-411.

[4] Murr MM, Yang J,Fier A, et al. Pancreatic elastase induces liver injury by activating cytokine production within Kupffer cells via nuclear factor-Kappa B. J Gastrointest Surg, 2002,6: 474-480.

[5] Sala FG, Matthews JA, Speer AL,et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.Tissue Eng Part A, 2011, 17: 1841-1850.

[6] Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol, 2008, 8: 958-969.

[7] Lundberg AH, Eubanks JW 3rd,Henry J, et al. Trypsin stimulates production of cytokines from peritoneal macrophages in vitro and in vivo. Pancreas, 2000, 21: 41-51.

[8] Jaffray C, Mendez C, Denham W, et al. Specific pancreatic enzymes activate macrophages to produce tumor necrosis factor-alpha: role of nuclear factor kappa B and inhibitory kappa B proteins. J Gastrointest Surg, 2000, 4: 370-377.

[9] Lee PH, Lee JE, Kim HS, et al. A randomized trial of mesenchymal stem cells in multiple system atrophy.Ann Neurol, 2012, 72:32-40.

[10] De Martino M, Zonta S, Rampino T, et al. Mesenchymal stem cells infusion prevents acute cellular rejection in rat kidney transplantation. Transplant Proc, 2010, 42:1331-1335.

[11] Newman RE, Yoo D, LeRoux MA, et aI. Treatment of inflammatory diseases with mesenchymaI stem cells. lnflamm Allergy Drug Targets, 2009, 8：110-123．

[12] Togel F, Hu Z, Weiss K, et al．Administered mesenchymal stem cells protect against ischem ic acute renaI faiIure through diferentiation-independent mechanisms．Am J Physiol Renal Physiol, 2005，289:F31-F42．

[13] Glennie S，Soeim I，Dyson PJ，et al．Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells．Blood，2005,105:2821-2827．

[14] Gao K，Chen Y，Wei L，et al．Inhibitory effect of mesenchymal stem cells OH lymphocyte proliferation．Cell Biochem Funct，2008,26:900-907．

[15] Sotimpoulou PA，Perez SA，Gritzapis AD，et al．Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells．Stem Cells,2006,24:74-85.

2012-02-25)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.018

黎介寿院士肠道屏障研究专项基金(LJS-2009015)

325000 温州，温州医学院附属第一医院消化科(孙学成、吴明、朱启槐)，普外科(余震)

余震，Email：Yuzhen0577@yahoo.com.cn