赵 波 杨惠林 吴志良 张志刚

苏州大学附属第一医院骨科，江苏苏州 215006

慢性肾病是指持续3个月以上的慢性肾损害或肾功能下降。当前慢性肾病已成为严重的公共健康问题，流行病学调查显示我国成年人群中慢性肾病发病率高达10.8%[1]。由于慢性肾病可引起矿物质代谢紊乱、继发性甲状旁腺功能亢进及内分泌紊乱等，患者常合并肾性骨营养不良，导致骨量的丢失及骨强度的下降，骨折风险显著增加。目前的研究热点主要在慢性肾病患者骨折的危险因素及骨折预防方面，然而慢性肾病对骨折愈合的影响尚不十分清楚。因此，本研究应用慢性肾病大鼠胫骨骨折模型，研究慢性肾病对大鼠骨折愈合质量的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

2个月龄雄性SD大鼠40只，体重200 g左右，由苏州大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后，将大鼠随机分为对照组与实验组，每组20只。实验组给予含0.75%腺嘌呤（SIGMA公司提供）饲料饲养，对照组予以普通饲料喂养。4周后，颈静脉抽血检测血清肌酐、尿素氮、钙、磷及甲状旁腺激素（PTH）水平，确定肾病造模成功，然后行右胫骨中段骨折造模及内固定。具体方法为：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上，右后肢硫化钠脱毛、安尔碘消毒，于右小腿中段前方做纵形皮肤切口，长约1 cm，暴露胫骨中段，环形剥离部分骨膜，用微型锯于胫骨结节下方约1 cm处横行锯断胫骨干，1 mm克氏针髓腔内固定，生理盐水冲洗伤口后，1号丝线分层缝合切口，腹腔注射青霉素10万U。两组大鼠术后均给予普通饲料喂养，自由饮水。骨折造模4周后，过量麻醉处死动物，切取右侧胫骨，拔除内固定，剔除软组织，4%多聚甲醛固定，-20℃冷冻备用。

1.2 Micro CT分析

标本室温下解冻后，采用Skyscan 1176 Micro CT（苏州大学骨科研究所）进行标本全长扫描，层间距18 μm，扫描电压50 kV，电流200 mA。扫描完成后将数据传输到图形工作站，应用Micro CT分析软件进行图像重建及3D分析。在CT扫描定位图上，以骨折线为中心，选取上下各100个扫描层面（共3.6 mm）进行骨痂形态学分析，应用线性插值方法，手动描绘出每个扫描层面的骨痂组织边界，分析参数包括组织总量（total bone volume，TV）、骨量（bone volume，BV）和骨体积分数（BV/TV）。

1.3 生物力学测量

完成 Micro-CT扫描后，应用Instron E10000型力学试验机（苏州大学骨科研究所）进行三点弯曲试验。测量时保持标本位置一直，承载点宽度20 mm，加载点为骨折部位，加载速度2.5 mm/min，记录力-变形曲线，测试标本的最大载荷、强度、能量吸收。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾病造模4周后血清钙、磷、肌酐、尿素氮及甲状旁腺激素的变化

给予含0.75%腺嘌呤饲料喂养4周后，实验组大鼠肾脏肿大、苍白、包膜下见黄褐色颗粒状；血清磷、肌酐、尿素氮、PTH均较对照组明显升高（P＜0.05）；但血清钙离子浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 肾病造模4周后血清钙、磷、肌酐、尿素氮及PTH的变化（±s）

表1 肾病造模4周后血清钙、磷、肌酐、尿素氮及PTH的变化（±s）

注：PTH：甲状旁腺激素

组别 只数 钙（mmol/L）磷（mmol/L）肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）PTH（ng/L）对照组实验组20 20 t值 P值2.22±0.22 2.03±0.21 1.88＞0.05 2.57±0.36 5.96±0.79 12.31＜0.05 23.55±2.92 227.07±51.41 12.49＜0.01 4.56±0.35 46.41±7.67 17.22＜0.01 111.20±8.14 1268.50±65.36 22.66＜0.01

2.2 Micro CT分析

骨折造模术后4周，两组大鼠骨折均无明显的畸形愈合，无内固定弯曲、断裂等，去除内固定后无骨折部位无肉眼可见的活动及成角。Micro CT扫描二维及三位图像重建显示，对照组骨折断端有连续的骨性骨痂连接；实验组骨折断端以软骨痂为主，骨性骨痂不连续（图1）。骨痂组织3D分析结果显示，实验组BV、TV、BV/TV也较对照组明显降低（P ＜ 0.05）。 见表2。

表2 骨痂组织Micro CT分析（±s）

表2 骨痂组织Micro CT分析（±s）

注：TV：骨痂组织总量；BV：骨性骨痂量；BV/TV：骨体积分数

组别 只数 TV（mm3）BV（mm3） BV/TV（%）实验组对照组t值P值20 20 18.45±2.11 29.60±2.45 18.21＜0.01 7.12±3.40 15.65±1.32 8.43＜0.01 40.77±2.27 44.65±2.12 2.40＜0.01

2.3 生物力学

在三点弯曲力学测试中，所有标本均于骨痂组织处断裂。实验组标本最大载荷、强度、断裂能量均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三点弯曲力学测试结果（±s）

表3 三点弯曲力学测试结果（±s）

组别 只数 最大载荷（N） 强度（N/mm） 断裂能量（N·mm）实验组对照组20 20 t值 P值34.85±9.39 46.42±3.26 4.76＜0.01 47.65±5.64 103.79±4.12 3.23＜0.01 7.17±4.47 14.25±2.21 9.61＜0.01

3 讨论

最新的流行病学资料显示，我国慢性肾病患者已超过一亿[1]，是世界上慢性肾病患者最多的国家。慢性肾病引起矿物质代谢紊乱、继发性甲状旁腺功能亢进、活性维生素D3缺乏，严重影响骨代谢，造成患者骨量减少、骨强度下降，骨折风险显著增加。研究发现慢性肾病患者骨折风险随着肾小球率过滤的下降而增加[2]，终末期慢性肾病患者髋部骨折风险是正常人群的4倍[3]。由于慢性肾病在老年人群的发病率最高[4]，老年患者常合并绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松，因此骨折风险进一步增加。当前国内外的研究热点主要在慢性肾病患者的骨折风险及预防方面，而慢性肾病对骨折愈合的影响尚不是很清楚。

常用于建立大鼠慢性肾病模型的方法的有部分肾切除、单侧肾动脉结扎+对侧部分肾切除、肾毒性药物等。Terai等[5]对比研究了部分肾切除及腺嘌呤饲养法，认为应用腺嘌呤喂养建立大鼠慢性肾病模型具有快速、稳定、病死率低等优点。本研究应用含0.75%腺嘌呤饲料喂养的方法建立大鼠的慢性肾病模型，在给药4周后，观察到血清肌酐、尿素、磷的显著升高，肉眼观察大鼠肾脏肿大、苍白、肾脏表面可见黄褐色颗粒，符合慢性肾病的病理改变。

Micro CT具有极高的分辨率，能清楚显示骨组织内部结构，通过图像重建技术及3D形态学分析，可准确反映骨折愈合情况及骨痂微细结构的变化，具有普通X线摄片无法比拟的优势。本研究观察到在骨折后第4周，实验组大鼠骨折部位没有连续性的骨性骨痂形成，骨痂内非矿化成分较多；而对照组大鼠骨折线消失，骨折断端骨痂组织连续，骨痂改建较好。3D分析显示，实验组大鼠TV、BV、BV/TV均较对照组下降，表明在骨折愈合早期，实验组大鼠骨折愈合过程中成骨能力下降、骨痂矿化延迟。

生物力学测试是评价骨折愈合质量的金标准。由于实验组大鼠骨痂组织以非矿化的软骨痂为主，其力学性能较差，三点弯曲力学测试发现其最大载荷、强度及能量吸收较对照组分别下降了24.9%、54.5%、49.7%。

骨折愈合是一个复杂的过程，由于参与骨折愈合的组织细胞对应变的耐受能力不同，在骨折愈合的不同阶段，有其特殊的组织细胞反应。在骨折愈合初期，骨折部位应变较大，主要由能耐受高应变的肉芽组织及软骨修复；当局部应变小于1%的时候，成骨细胞开始活动，局部形成编织骨替代软骨痂；在骨折愈合的后期，破骨细胞开始活跃，编织骨及矿化软骨逐渐被吸收，取而代之的是排列规整的板层骨。成骨细胞及破骨细胞的功能与活性是影响骨折愈合的重要因素，任何原因造成骨折愈合过程中成骨减少或骨吸收增加都会影响骨折愈合过程中骨痂的质量。

慢性肾病可通过多种机制影响骨折愈合质量。继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）可能是影响骨折愈合的重要原因之一。本研究发现，大鼠给予含腺嘌呤饲料喂养4周后，血清PTH浓度升高到正常的10倍以上。研究发现，PTH对成骨细胞分化具有双重作用，间歇性地给予PTH可促进其分化，而持续性给予PTH则对成骨细胞的分化产生抑制作用[6]。同时，成骨细胞对PTH的抵抗可能是成骨细胞活性下降的另一重要原因，慢性肾功能不全时成骨细胞表达PTH1型受体下调[7]，PTH抵抗可能是SHPT的重要原因[8]，在慢性肾病的患者，PTH需要升高到正常的2～4倍才能维持正常的骨代谢[9]。成骨细胞在骨折愈合过程的主要功能是合成、分泌骨基质及促进类骨质矿化。持续性的高水平PTH势必导致成骨细胞分化障碍，影响骨折愈合。此外，血液中高浓度的PTH可促进破骨细胞分化因子（RANKL）的表达，RANKL与破骨细胞前体细胞膜上的核因子-κB受体活化因子（RANK）结合，启动细胞内信号转导，引起级联反应，促进破骨细胞分化、活化，抑制破骨细胞的凋亡[10]。近年来发现破骨细胞本身也表达PTH1型受体，在体外单独培养的破骨细胞中，PTH通过直接作用于破骨细胞促进其骨吸收活性[11]。成骨细胞与破骨细胞的功能失衡，导致骨折愈合过程中新骨生成的减少、吸收增加及矿化障碍，最终导致骨痂量的减少和机械强度下降。另外，慢性肾病引起的钙磷代谢紊乱、肾性贫血、低蛋白血症、性腺功能低下、代谢性酸中毒、铝中毒等可能同样会对骨折愈合过程产生不良影响。

总之，本研究应用慢性肾病大鼠骨折模型，通过生物力学测试及Micro CT分析等方法，首次观察到慢性肾病大鼠骨折愈合过程中骨痂质量及力学性能的下降，从而影响骨折愈合质量。然而慢性肾病影响大鼠骨折愈合的细胞、分子机制尚不清楚，其对骨折愈合中、晚期的影响也有待进一步研究。

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