郑 超，徐羽贞，黄逸凡，刘 振，闫克平

（浙江大学化学工程与生物工程学系，生物质化工教育部重点实验室，浙江 杭州 310027）

低温等离子体是部分电离的气体，包含多种物理和化学效应，如紫外辐射、电磁场、热效应、带电粒子和活性粒子等。这些物理化学效应具有足够的能量打破化学键并启动一系列化学反应，在与细胞作用时则体现出多样的生物学效应。等离子体的细胞学效应主要包括致死作用和非致死刺激作用，前者可用于针对微生物的消毒灭菌，后者可用于生物医药。由于真核生物强于原核生物的自我修复能力以及组织间的联合作用，高等动物细胞和组织对等离子体的敏感度小于微生物。通过控制不同的等离子体作用方式和剂量，可以将等离子体应用在不同的生物学领域[1]。低剂量的等离子体可杀灭微生物但不影响动物细胞，从而实现皮肤的消毒灭菌。中等剂量的等离子体对动物细胞和组织造成非致死的刺激，可应用于伤口的快速愈合。等离子体诱导癌细胞的凋亡过程使其成为治疗癌症的有力手段。等离子体的剂量过高时，则会杀死动物细胞并使组织器官坏死。

由于等离子体与生物细胞各自都具有相当的复杂性，其具体相互作用过程目前还没有定论。然而，基于生物学效应的等离子体技术和装备不断被研发出来，已领先于基础问题的研究。本文从应用角度出发，综述了低温等离子体技术在生物学上的研究进展，包括等离子体对医疗器械的消毒灭菌、水和空气的净化、食品及包装材料的处理以及最新的等离子体医药技术。

1 等离子体灭菌技术

1.1 等离子体对医疗器械的消毒灭菌

等离子体灭菌技术的研究始于20世纪60年代，用于医疗器械及包装材料的处理。早期的低温等离子体灭菌器多采用低气压条件，一般包括等离子体激发源、真空系统和密闭的等离子体反应室。1987年，Jacobs申请了第一个关于过氧化氢等离子体灭菌器的专利，数年后，美国的强生公司研发出商用的STERRAD®灭菌器并成功上市，目前已在50多个国家的医院推广使用[2-3]。Krebs等[4]指出，过氧化氢等离子体灭菌器中的过氧化氢蒸气自身起着重要的杀菌作用，而其电离成等离子体的过程是去除残余的过氧化氢，并且该灭菌器对细菌芽孢的杀灭作用有限。开发灭菌能力更强，灭菌过程更快速的等离子体灭菌器成为后来的发展趋势。等离子体对材料的蚀刻过程被借鉴于灭菌器的设计，采用微波等离子体以及多种具有等离子体蚀刻作用的气体，Lerouge等[5]报道了等离子体灭菌器中不同气体组分对细菌芽孢的蚀刻和杀灭作用，结果蚀刻速率越高则灭菌效率越高。Moisan等[6-7]通过研究微波等离子体余辉的灭菌作用，指出氧原子自由基以及紫外光子对灭菌有重要的影响。Ar、O2、N2及其混合气体表现出不同的灭菌效果，其中O2的加入能显著提高纯Ar或N2的灭菌效果，O2和N2共存时产生的NOγ紫外辐射则能提供额外的杀菌动力。2006年，欧盟发起了一个利用低温等离子体处理医疗器械的研究项目 European project BIODECON，除了考察灭菌效果外，还研究了生物大分子的灭活作用，以消除诸如朊病毒、生物毒素等的危害[8-10]。当放电气体为10 Pa Ar，等离子体功率为150 W，处理时间为10 s时，枯草芽孢杆菌孢子被杀灭4.5个对数。用等离子体来清除载体表面的多聚氨基酸时，清除速率取决于气体的组分及等离子体的特性。控制Ar/O2/N2的比例为7.5∶1∶4时，即可得到高效的灭菌效率，也能实现有害生物大分子的快速破坏和蚀刻，在实际医疗器械消毒过程中有着重要的意义。

低气压等离子体灭菌器由于需要昂贵复杂的真空系统，限制了其应用，使得一些科研人员转向常压等离子体灭菌器的研究。几种典型的等离子体灭菌器及其对比见表1。低压气体更易电离，并且可在较大的电极间距内产生大体积等离子体，常压条件的优点则是操作简便，但等离子体的发生相对困难，故多采用惰性气体。2005年，Laroussi等开始研究常压等离子体射流的灭菌效应及其在医疗上的应用，这类等离子体发生器结构小巧，便于携带和操作，根据结构的差异，又称为plasma jet、plasma torch或plasma flashlight等[11-13]。由于单个等离子体射流的作用范围较小，Cao等[14]报道了将多个反应器并联的方法，从而得到大面积的等离子体射流阵列，处理效率大大提高并实现了对手术刀等医疗器械的消毒灭菌。Morf i ll等[15]发明了另一种基于空气中微放电的等离子体消毒器（Plasma dispenser），可在大的平面内产生均匀的等离子体。电极为铜-聚四氟乙烯-不锈钢丝网组成的三明治结构，不锈钢丝网周围产生均匀的功率为0.5 W/cm2的微放电等离子体，两组电极相对放置时构成消毒腔，可对其中的物品进行有效的灭菌。这种新兴等离子体灭菌器的另一优点是可以直接对手进行消毒，有望在医院、公共场所甚至家庭中推广。

1.2 等离子体净化水中的微生物

等离子体净化水/空气中微生物的过程见表2。通过水下或水面的脉冲放电，等离子体灭菌过程中无需添加任何化学杀菌剂，是一种环境友好的水处理技术。等离子体灭菌的效率与一系列因素有关，如等离子体发生系统、水的电导率及处理微生物的种类等，注入水中的能量密度和水中微生物减少的对数常用于评估其效率[16]。

表1 典型用于医疗器械的等离子体灭菌器

1988年，Mizuno等[17]首次研究了高压脉冲放电对水中微生物的作用，采用棒-棒式反应器和电弧放电，21～42 J/mL的能量密度使酵母菌密度下降了6个对数。当电极结构为棒-棒/针-板式时，电极间距较远产生电晕/流光放电，间距较近时则产生火花/电弧放电。Vaze等[18]的研究表明，水下火花/电弧放电的灭菌效率高于电晕/流光放电，当大肠杆菌的初始密度为106cfu/mL时，1 J/mL的火花放电等离子体可使大肠杆菌下降3.5个对数。线-筒式反应器可以拥有较大的放电面积，但需要使用纳秒脉冲电源以实现沿线电极的同步均匀放电。Gupta等[19]采用镀有微孔陶瓷的钛棒设计了一种线-筒式等离子体灭菌反应器，恶臭假单胞菌的初始细胞浓度为4×106cfu/mL时，20 J/mL的能量密度可使活菌密度下降6个对数。采用线-筒式反应器和纳秒脉冲，Fudamoto等[20]比较了连续处理与单批处理的区别，发现实现相同的灭菌效率前者所需的能量密度高于后者10倍以上。

水下放电和水面放电各有其优缺点，产生的等离子体也差异显著。水下放电需要的击穿场强较高而难以形成，但形成的等离子体易于在水相传播。水面的气相放电所需的击穿场强较低从而易于形成，但水面产生的等离子体向水相传播时可能受空间的限制，且发射光谱和活性粒子的种类也与水下放电有较大区别。Zheng等[21]采用沿水面的火花放电杀灭水中的大肠杆菌，当细菌密度低于106cfu/mL时，60～300个脉冲处理后可杀灭水中所有的细胞，所需时间仅数秒，消耗的等离子体能量密度为0.4～2.0 J/mL。等离子体发生系统的差异导致灭菌的效率和能耗也高低各异，但效率较高的等离子体灭菌系统可在约1 J/mL的能量密度下将水中的微生物密度降低数个对数[21]。

表2 等离子体净化水和空气的过程

等离子体技术的优势在于高效快速，可用于饮用水、生活用水和污水的消毒灭菌，也可用于海水的灭澡，但等离子体、水和细胞三者之间的相互作用较为复杂，其内在的灭菌机理尚不完全确定。通过优化等离子体发生系统，进一步提高等离子体的灭菌效率并降低能耗是今后的主要研究方向，设计合理的连续运行系统是实现其工业化的关键。

1.3 等离子体净化空气中的微生物

随着SARS和禽流感等病毒的出现，空气的生物安全日益重要。为了解决空气中的微生物被滤膜截留后仍然存活和繁殖的问题，Wintenberg等[22]将辉光放电等离子体和滤膜结合在一起，然后间歇性的杀灭滤膜上的微生物，开发的装备称为“Volfilter”。基于介质阻挡放电（DBD）直接杀灭通过放电电极的微生物，Gallagher等[23]开发了一套等离子体空气灭菌设备，如表2中所示。电极为外面镀有0.5 mm厚石英绝缘层的1 mm铜线，形成厚度约2 mm的薄层，当空气流量为25 L/s，停留时间约为0.73 ms时，一次通过可使空气中的细菌密度下降1.5个对数。针对流感病毒的危害，Terrier等[24]报道了利用氧气等离子体杀灭空气中病毒的研究。空气流速为0.9 m/s，停留时间为0.44 s，副流感病毒、合胞病毒和流感病毒分别下降了6.5、3.8和4个对数。Park等[25]将DBD等离子体应用于堆肥工厂，以同时去除废气中的气味和微生物气溶胶。反应器由相距5 mm的16张薄层电极构成，其中高压和接地电极交错放置，气体流速为30 L/min时，1.1×104cfu/m3的微生物气溶胶被杀死89%。

等离子体可处理大风量空气中的微生物气溶胶，在气流通过反应器的瞬间将微生物密度下降数个对数，有广泛的工业应用前景。然而，空气放电后难免产生微量的臭氧、氮氧化物等化学残留，对人体造成潜在的危害。在高效杀灭空气中微生物的同时，如何减少或清除有害化学残留，是实现商业化之前需要解决的首要问题。

1.4 等离子体处理食品、粮食及包装材料

工业上的食品包装材料需要数秒内达到灭菌标准，并且不破坏其性能，等离子体技术可实现这一特点。2002年，Trompeter等[26-27]报道了一种适于放大和工业化应用的常压等离子体装备，用于食品包装材料的消毒灭菌。采用平板式的介质阻挡放电，配以可移动的传送台，连续处理速度达7 m/min。等离子体的杀菌效率与气体介质和功率有关，PET薄膜上的枯草芽孢杆菌孢子在数秒内被杀死4个以上的对数。近年来，利用等离子体处理食品包装材料成为研究的热点，Song、Leipold等[28-29]开发了杀灭密封包装袋内微生物的等离子体灭菌方法，用于食品的先包装后灭菌。

通过直接处理鸡蛋、鸡肉、猪肉和鱼肉等食品，等离子体被证实能有效杀灭食品中常见的致病菌，如沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等[30-31]。Deng等[32]利用常压平板式DBD等离子体处理杏仁表面大肠杆菌，当放电条件为30 kV、2 kHz时，30 s后细菌密度下降5个对数。粮食的损失主要由霉菌引起，如何有效杀灭粮食中的霉菌及其孢子，是减少粮食储藏损失的关键。Selcuk等[33-34]采用低气压等离子体处理稻谷和大豆，15 min后曲霉菌和青霉菌的数量下降了3个对数，黄曲霉毒素则减少50%，但种子仍然保持着85%以上的萌发性。等离子体杀灭霉菌和分解霉菌毒素的功能使其成为粮食处理的有力手段。然而，等离子体处理粮食的研究尚处于起步阶段，设计大面积的等离子体发生器和高通量的连续处理系统，是以后的发展趋势。

2 等离子体生物医药

2.1 皮肤消毒、细胞分化和伤口愈合

精确控制等离子体作用在动物细胞和组织上的剂量是实现医药应用的关键，用于医药的等离子体剂量见表3。等离子体中的活性成分取决于气体介质，主要包括紫外辐射、带电粒子和活性粒子等。紫外辐射对细胞内DNA的破坏是等离子体灭菌的重要原因之一，但在处理动物细胞和组织的过程中，为了避免诱发不必要的基因突变，需要严格控制其辐射剂量在安全范围之内。等离子体中的自由基和活性粒子与细胞和生物大分子之间的化学反应起着重要的灭菌贡献，同时也能诱发动物细胞内一系列的链式生化反应。活性氧粒子（ROS）和活性氮粒子（RNS）在细胞生理学中起着重要的作用，细胞的天然代谢途径和信号传导过程中含有这些活性粒子，被认为影响着一系列疾病的发生和治疗，包括糖尿病、癌症、心血管疾病和免疫类疾病等[35]。NO是广为人知的细胞内信号分子，也被用来治疗多种疾病[36]。以空气为介质产生的等离子体，或惰性气体等离子体射流接触空气时，都会生成与细胞内部天然存在类似的ROS和RNS，这些活性粒子是等离子体医药应用中的关键成分，作用于动物细胞和组织时，刺激细胞和组织产生一系列的生理生化反应，从而达到临床治疗的效果[37]。低温等离子体在生物医药领域最有潜力的应用之一是对皮肤特别是伤口的直接处理，在消毒灭菌的同时实现刺激细胞分化和促进伤口的愈合。

表3 用于医药的等离子体剂量

等离子体与离体动物细胞之间的生化反应是当前研究的热点，有助于阐明等离子体医药的机理。Stoffels等[38]自2001年起最早开始研究等离子体对动物细胞的刺激和分化作用。反应器为便携式的等离子体针，由直径4 mm的有机玻璃管和中间一根直径0.3 mm的钨丝组成，氦气从有机玻璃管的一端通入，在钨丝尖端处电离产生直径数毫米的等离子体。利用等离子体处理CHO-K1细胞，发现在不损坏细胞的前提下能精确的使细胞之间分离，然后又能重新聚集黏附[39]。这被认为是等离子体与细胞之间最细微温和的操作，其过程与钙黏蛋白和整合蛋白有关，在外科手术中有重要的意义，可用于精确切除病变组织而不伤害周围正常组织，在皮肤/器官移植方面也有潜在的应用。加大处理CHO-K1的等离子体剂量时，发现使其致死的剂量要10多倍高于使大肠杆菌致死的剂量。利用等离子体处理成纤维细胞3T3，最佳处理时间为5～15 s，如此短时间的等离子体处理并不对细胞造成损伤，反而使细胞生长繁殖速度加快，可能是等离子体对细胞的轻微损伤刺激了细胞内的修复功能和黏附分子的释放，这一现象可应用于伤口的快速愈合[40]。利用等离子体处理牛主动脉上皮细胞，10 s后可以使细胞分离，且不同的等离子体剂量会产生细胞的凋亡或坏死，这些现象在等离子体作用过后6 h才能观察到[41]。等离子体诱导细胞凋亡的功能可避免常规手术中组织坏死引发的炎症。Fridman等[42]用空气中的悬浮电极介质阻挡放电（FE-DBD）等离子体处理猪主动脉内皮细胞，30 s后可刺激细胞的增殖，同时检测到生长因子的释放，处理60 s后大于75%的细胞仍然存活，处理120 s后则观察到大量细胞死亡。Haertel等[43]的研究同样显示，氩气等离子体射流作用于HaCaT角质细胞30 s后监测到一系列生长因子的变化，比如钙黏蛋白和表皮生长因子减少而整合蛋白增多，这些生长因子与细胞的迁移和增殖密切相关，对伤口的愈合有着重要的影响。

近5年来，等离子体作用于动物或人体的研究也逐渐报道出来。Dobrynin等[44]采用FE-DBD等离子体处理离体的人体皮肤，6 s后就达到了医院的消毒标准，5 min后用肉眼和组织显微镜都观察不到组织损伤，说明等离子体可在不损伤皮肤的情况下进行快速消毒。Lademann等[45]开展了利用等离子体射流消毒猪耳朵的实验研究，氩气等离子体射流的移动速度为10 mm/s，在皮肤上的平均停留时间为0.3 s时，约94.1%的细菌被杀死，整个过程中皮肤温度低于40℃，激光扫描显微镜观察不到真皮组织的损伤。Chakravarthy等[46]设计了一种处理小鼠结肠溃疡的等离子体装置，其直径小于2 mm，从小鼠肛门插入4 cm到达结肠并处理30 s，7天后能有效治疗结肠溃疡。伤口的细菌感染是临床医学上的一大难题，目前普遍采用抗生素等药物来预防和治疗，但随着抗药菌（如MRSA）的不断出现，给伤口愈合带来更多困难，特别是诸如大面积烧伤后产生的感染性溃疡。等离子体灭菌的高效性和广谱性有望解决这一问题。Heinlin等[47-48]开发了一套利用等离子体射流治疗人体伤口和溃疡的装备，85W的氩气等离子体由2.45 GHz微波激发，得到直径为35 mm的射流，温度可控制在45℃以下，用于临床治疗36名慢性伤口感染患者的结果显示，等离子体处理后伤口的细菌总数明显减少，在不对患者造成痛苦的前提下预防了伤口的进一步感染，加上等离子体对细胞的分化刺激作用共同促进了伤口的愈合。这一临床试验是等离子体医药技术的一大飞跃。

2.2 皮肤病的治疗

多种皮肤病都与细菌或真菌感染有关，等离子体直接作用于皮肤的杀菌能力有望辅助这些疾病的治疗，比如皮炎、毛囊炎、湿癣和足癣等[49]。利什曼皮肤病（Cutaneous Leishmaniasis）是一种由利什曼虫引起的广泛分布的皮肤病，每年约有50万病例，发病后期可能向内脏转移而致死，目前的治疗药物相当昂贵。Fridman等[50]的研究表明可以通过低温等离子体来治疗这一疾病。采用不同剂量FE-DBD等离子体处理利什曼虫，同时处理人体中的巨噬细胞作为对照，20 s后100%的利什曼虫被杀死，2 min后巨噬细胞的致死率只有20%～30%，说明等离子体可在不损坏人体的条件下高效快速的杀灭这一致病寄生虫。除了微生物导致的疾病，另外一些基因缺陷或免疫类疾病也可通过等离子体来治疗。家族性良性天疱疮（Hailey-Hailey disease）是一种少见的常染色体显性遗传病，致病基因与编码一种钙离子泵的基因ATP2C1突变有关，表现为一个皮肤部位多发性水疱、糜烂、结痂和瘙痒。Isbary等[51]利用氩气等离子体射流一方面减少细菌的重复感染，另一方面通过活性粒子（ROS和RNS等）刺激细胞内的生化反应，在临床上成功的治愈了这一疾病。

2.3 细胞的凋亡和癌症的治疗

等离子体诱导细胞凋亡的功能使其成为治疗癌症的有力手段。黑素瘤（Melanoma）是医学上常见的一种致死性皮肤癌，美国每年有25000个恶性黑素瘤新增病例，死亡约6000人。由于直接暴露在皮肤上，有望通过等离子体对皮肤的作用来直接治疗或辅助治疗黑素瘤。Sensenig等[52]利用FE-DBD等离子体处理黑色素瘤细胞ATCCA2058，5 s后可诱导细胞凋亡，时间超过15 s则使细胞坏死。等离子体处理后的细胞并非立即死亡而是停止生长，在12～24 h后才表现出凋亡，研究显示这是细胞内部一系列生化反应引起的程序性死亡，而且细胞的死亡并非由等离子体处理后培养基中环境的变化引起的，而是等离子体直接与细胞作用的结果。Lee等[53]采用等离子体射流处理黑素瘤细胞，发现等离子体通过抑制整合蛋白的表达以及降低黏附蛋白的活性来诱导细胞的凋亡。Vandamme等[54]评价了等离子体诱导恶性胶质瘤（glioblastoma U87MG）和结肠瘤（colorectal carcinoma HCT-116）凋亡的过程，指出活性氧粒子起着重要的作用。用等离子体处理活体小鼠身上的恶性胶质瘤，5天后肿瘤细胞的生物发光性明显减弱，同时肿瘤体积也明显缩小，证实了治疗肿瘤的潜在可行性[55]。

2.4 液的凝固和快速止血

2006年，Fridman等[56]首次报道了等离子体的快速凝血作用。采用FE-DBD等离子体反应器在石英玻璃表面产生微放电等离子体，处理体外血液15 s后，血液在1 min内凝固，而不加处理时则需要15 min。用等离子体处理体外人脾上的切口30 s，切口得到迅速止血，对照组则流血不止。Kalghatgi等[57]随后研究了FE-DBD等离子体的凝血机理。凝血过程中的钙离子浓度和pH值都不变，热效应和电场的作用也可忽略不计。等离子体处理缓冲液中的血清蛋白观察不到任何变化，但处理缓冲液中的纤维蛋白原后很快出现了蛋白的凝聚现象，而纤维蛋白原的凝聚正是天然血液凝固的重要原因，说明等离子体与纤维蛋白原之间的化学反应是是等离子体凝血的可能原因之一。Kuo等[58]利用空气等离子体射流研究了活体上的凝血过程，在活体猪的耳动脉上切割伤口后，等离子体处理12 s可快速止血，并且在之后的伤口愈合过程中，等离子体处理过的伤口愈合速度明显快于对照组，由14天缩短到8天。Baik等[59]研究了空气、氮气和氩气等离子体射流对血液中细胞的影响，结果氩气等离子体对血液的毒性较小，氮气等离子体造成最严重的溶血现象，空气等离子体容易使白细胞发生分化。等离子体与血细胞和血液中其它成分的化学反应，还不得而知，等离子体凝血的确切机理有待更深入的研究。

2.5 牙科和龋齿的治疗

牙齿的消毒和龋齿的治疗是等离子体射流的另一重要医学应用。变形链球菌、粪肠球菌、干酪乳酸菌和白色念珠菌等是导致龋齿的重要细菌，常用来评价等离子体杀菌技术在牙科上的效果。2006年以来，出现多个利用等离子体射流杀灭琼脂平板或牙齿上龋齿菌的研究，证实了利用等离子体治疗龋齿的可行性[60]。Koban等[61]指出，利用具有蚀刻作用的等离子体能更有效的去除龋齿内的生物膜，以根除这一疾病。与用于治疗龋齿的洗必泰杀菌剂相比，10 min的等离子体处理能使细菌密度下降5个对数，而杀菌剂只能杀死1.5个对数。另外，利用Ar/O2等离子体处理假牙（人牙、象牙和羟基磷灰石）表面后，假牙的水接触角减小，假牙与成骨细胞的接触与贴合得到改善，这为治疗牙周炎等疾病提供了新的辅助途径[62]。

2.6 化妆和美容

除了在治疗领域的应用，低温等离子体在化妆和美容领域也有新的研究，比如利用等离子体射流对牙齿进行美白、等离子体皮肤再生（Plasma Skin Regeneration，PSR）、脸部返老还童（Full-Facial Rejuvenation）以及去皱除疤等[63]。美国的Rhytec公司推出的等离子体整形机Portrait®PSR3已获FDA的批准推向市场。该机器由射频电源产生氮气等离子体射流，温度小于60℃，作用于皮肤表层500 μm以内，可以去除死亡细胞并刺激胶原蛋白的产生和新细胞的分化，从而使老化皮肤得到更新。

等离子体在生物医药领域的研究虽然只有短短十年，目前已成为国际研究的热点，不断有新的等离子体医疗装备研制出来，部分装备已实现了五年以上的临床实验[64]，是一项很有潜力的应用技术，有望在数年后实现大规模的商业化。

3 结论

利用各种不同的高压电源和反应器，可以产生性状特异的多种低温等离子体，这些等离子体与不同种类的细胞相互作用时形成多种生物学效应，如致死和亚致死效应，在不同的领域得到广泛的应用。等离子体对微生物的致死作用成功的运用于医疗器械的消毒灭菌之后，目前在水、空气、食品包装材料、食品和粮食的消毒灭菌等领域展现出巨大的潜力，有望在不久的将来实现商业化。精确控制等离子体的剂量时，等离子体展现出对动物细胞的亚致死刺激效应，使其在临床生物医药领域的应用得以实现，如皮肤的消毒灭菌、伤口的快速愈合、皮肤病的治疗、癌症的治疗等。等离子体与细胞之间的相互作用机理，以及相关等离子体技术和装备的开发，成为目前的两大研究热点和方向。

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