詹俊杰，李 竹，李江华，牟基伟，周旭峰，张美佳，杨琳红，夏 军，魏晓丽

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003;2.山东省菏泽市中医院，山东菏泽274000)

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)可发病于任何年龄，但以中年肥胖男性为发病率最高。国外学者的的流行病学调查显示，OSAHS的发病率在一般人群中为2%～4%[1]。关于OSAHS的发病机制至今仍不十分明确，深入而全面的开展OSAHS的病因学和病理学等方面的研究，将为临床的病因诊断和治疗OSAHS提供新的理论依据，具有重要的现实意义和社会价值。

近年来不断有研究发现，血管活性肠肽(VIP)是一种具有很强的扩张血管的作用的神经肽类生物活性物质，在人体各种组织器官都有着广泛的分布，而且有文献报道其与正常睡眠结构的调节有着密切的关系，但与OSAHS的发病的相关报道少见。β－EP作为垂体分泌的具有阿片样生物活性的神经肽类物质，以神经激素的形式参与了众多复杂的生理功能的调节，它的异常分泌与许多疾病的发生发展有着密切的联系。它广泛存在于脑、垂体、胃肠道、血浆和胎盘中，表现出明显的阿片样活性，参与多种疾病或者应激反应的病理生理过程，如心血管活动、呼吸运动、体温调节、内分泌功能的调节等。本实验从VIP和β－EP在各学科研究的基础之上从低通气和睡眠结构的调节等角度来研究VIP和β－EP在OSAHS病情发生发展中的作用，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测VIP和β－EP在OSAHS患者血浆中的表达情况，并进一步探讨二者在OSAHS发病中的作用及其可能存在的相关性，为OSAHS的临床预防、病因诊断和治疗方面开辟一条新的思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 OSAHS组:为2011－01～2011－12在佳木斯大学附属第一医院就诊治疗的OSAHS患者45例，其中轻中度患者29例(其中男22例，女7例);重度患者16例(其中男13例，女3例)，年龄23～55岁，平均38.7岁。入院前经临床检查和多导睡眠监护仪(PSG)检查，严格按照2002年中华医学会呼吸病学分会杭州会议的OSAHS诊断标准。以呼吸暂停低通气指数(AHI)为标准对患者进行分度:AHI 5～20次/h为轻度组，AHI 21～40次/h为中度组，AHI＞40/h为重度组，本实验划定AHI≤40次/h为轻中度组;AHI＞40/h为重度组。

1.1.2 对照组:15例经PSG监测排除OSAHS诊断的健康成人在知情同意的合法程序下自愿接受晨起空腹采静脉血，其中男10例，女5例，年龄21～52岁，平均39.4岁。1.1.3 多导睡眠图(PSG)检查

所有研究对象均进行整夜的多导睡眠图(PSG)监测，获得相关临床指标。于监测前48h内不喝酒、咖啡、浓茶、不服用镇静药等，监测当天不睡午觉，2周内未患上呼吸道疾病。

监测项目:心电图、脑电图、口鼻气流、胸腹运动、睡眠体位、鼾声、血氧饱和度等。检查指标:AHI、ODT/TST、TST、鼾声指数、平均呼吸暂停时间、睡眠时平均血氧饱和度、睡眠时最高血氧饱和度、睡眠时最低血氧饱和度等。

1.2 方法

1.2.1 血浆标本的准备:所有研究对象均空腹，在次晨睡眠监测结束后即抽取外周静脉血4mL注入含EDTA的试管中保存，立即离心(4℃，2000×g)15min，取上层血浆分2份，1份备测VIP，另1份备测β－EP，均置－70℃冰箱保存待成批测量。标本符合:(1)无溶血;(2)清澈透明;(3)解冻1次;(4)保存时间不超过半年。

1.2.2 ELISA具体操作步骤:(1)实验准备:实验开始前，将血浆样本及试剂盒中的试剂在室温下完全溶解复温后在漩涡振荡器上震荡充分混匀。注意不要使液体产生大量的泡沫，以免产生加样上的误差。标准品和洗涤液照说明书稀释。打开酶标仪，预热，设置检测程序。(2)加样:分别设空白对照孔(复孔)、标准品孔(复孔)、样品孔。加入稀释好后的标准品50μL于标准品孔内;在样品反应孔中加入待测血浆样品50μL(用样本稀释液1:1稀释)，立即加入50μL的生物素标记的抗体，盖上封板膜，漩涡振荡器振荡混匀，37℃水温箱温育1h。(3)洗涤:甩去反应酶标板孔内液体，反应酶标板放入已设定参数的洗板机洗涤，洗涤4次，吸水纸拍干。(4)每孔加入60μL的亲和链酶素－HRP，旋涡振荡器混匀，37℃水温箱温育30min。(5)洗涤:甩去反应酶标板孔内液体，反应酶标板放入已设定参数的洗板机洗涤，洗涤4次，吸水纸拍干。(6)每孔迅速的按顺寻加入底物A和底物B各50μL，使用旋涡振荡器混匀，37℃水温箱温育10min。注意在加入底物A和底物B过程中避免光照。(7)取出反应酶标板，迅速加入50μL的终止液。注意避免光照。(8)在全自动酶标仪450nm波长处测定各孔的吸光度OD值。电脑打印实验结果。(9)以标准品吸光度OD值为纵坐标(Y)，以相应的VIP或β－EP标准品的浓度为横坐标(X)，绘制相应的标准曲线，根据标准曲线计算出各血浆中VIP和β－EP的浓度。

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0统计软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析;相关性分析采用 Pearson线性相关分析;P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VIP在OSAHS血浆中的表达

OSAHS组患者血浆中VIP为高表达，三组的VIP表达差异具有显著性(P＜0.01)。OSAHS轻中度组的VIP浓度显著高于对照组(P＜0.01);重度OSAHS组的VIP表达明显高于对照组和轻中度OSAHS组(P＜0.01)。提示血浆中的VIP参与了OSAHS的疾病发生发展过程，并且在其中扮演了重要作用见表1。

表1 VIP在OSAHS血浆中的表达(±s)

表1 VIP在OSAHS血浆中的表达(±s)

分组 n VIP(pg/mL)F P对照组15147.60±13.52 522.99 ＜0.01 OSAHS轻中度组 29235.83±16.14*OSAHS重度组 16323.75±14.72*#

2.2 β－EP在OSAHS血浆中的表达

OSAHS组患者血浆中β－EP为高表达，三组的β－EP表达差异具有显著性(P＜0.01)。OSAHS轻中度组的β－EP显著高于对照组(P＜0.01);重度OSAHS组的β－EP表达明显高于轻中度OSAHS组(P＜0.01)。提示血浆中β－EP参与了OSAHS的疾病发生发展过程，并且在其中扮演了重要作用，见表2。

表2 β－EP在OSAHS血浆中的表达(±s)

表2 β－EP在OSAHS血浆中的表达(±s)

分组 n β－EP(pg/mL)F P对照组15 82.47±16.47 453.98 ＜0.01 OSAHS轻中度组 29 165.17±16.58*OSAHS重度组 16 253.44±13.51*#

2.3 在OSAHS患者血浆中VIP和β－EP表达的相关性

在OSAHS重度组中，VIP的表达与β－EP的表达呈正相关(r=0.914)，有统计学意义(P＜0.01)。表明两者在OSAHS的发病过程中具有协同作用。联合检测二者可能对OSAHS的病因诊断及治疗效果的判断具有重要的理论和临床价值。

3 讨论

OSAHS主要的病理生理改变是呼吸暂停、低通气和睡眠结构紊乱导致的低氧血症、高碳酸血症和微觉醒，引起临床上出现一系列的症状和体征。OSAHS的致病因素较多，但确切的病因及发病机制尚不清楚，有研究显示有生物活性因子参与了其中的发生和发展[2，3]。

3.1 VIP 与 OSAHS

VIP与睡眠:正常睡眠可分为两个时相:快波睡眠(REM)和慢波睡眠(NREM)。调节睡眠的中枢在于脑干部到前脑基底部的区域，那里存在着作为神经细胞活动基础的神经结构和作为睡眠物质基础的液性机构等两种调节机构，正常睡眠结构的调节是在这两者的共同左右下完成的。Drucker－colin等[4]提出VIP可能是一种参与睡眠结构调节的生物活性因子。动物实验中，往猫、兔等哺乳动物脑室内注射一定量的VIP，可以导致其睡眠过程中REM睡眠时相的增加[4，5]，而给予VIP受体抑制剂可导致REM睡眠时相的减少[6]。进一步研究表明VIP能增加REM和NREM睡眠时间，减少NREM－REM循环次数，有增加REM/NREM比例的倾向。而OSAHS患者夜间由于反复觉醒可以导致REM睡眠期和NREM深睡眠期明显减少，睡眠结构紊乱，睡眠有效率下降，病情严重患者甚至会有白天嗜睡的现象。以上结论都提示VIP可能参与了OSAHS患者睡眠结构的调节。

VIP与缺氧:VIP是一种具有强烈的舒张血管作用的生物活性因子，动物试验中表明，缺氧缺血性脑损伤大鼠血浆及海马旁回匀浆中VIP含量增高，坏死神经元明显增加。动物实验中的家兔缺氧后可导致脑组织及肺内的VIP水平增高，引起局部血流增加，耗氧量增加。胎儿窒息时羊水和脐血中的VIP也明显高于非窒息组。缺氧缺血性脑病患儿血浆的VIP水平明显升高，可能与缺氧后脑血流的改变及再灌注损伤有关。以上研究提示缺氧可能是VIP释放的重要诱导因素，而缺氧导致的低氧血症又是OSAHS最主要的病理基础。加之OSAHS存在自主神经功能紊乱，这与有关学者提出的咽部组织中某些神经肽类物质尤其是VIP等参与的神经源性炎症是由于血浆中VIP增多引起OSAHS患者咽部血管扩张，血管的通透性增强，组织肿胀加重导致咽腔狭窄，引起咽部反射机制缺陷和局部组织损伤而诱导OSAHS的发生发展的观点是具有一致性的。故可推测OSAHS患者存在高VIP血症。

本研究VIP的ELISA结果显示:OSAHS组患者血浆中VIP为高表达，并且重度OSAHS组的表达明显高于对照组和轻中度OSAHS组，统计学结果支持重度OSAHS组与对照组，轻中度OSAHS组与对照组，轻中度OSAHS组与重度OSAHS组三者之间均有显著性差异(P＜0.01)。提示血浆中VIP参与了OSAHS的疾病发生发展过程，并且在其中扮演了重要作用。

在OSAHS患者的睡眠结构紊乱研究方面，鉴于REM期睡眠有极强的生理性节律[7]，所以有学者认为VIP可能是通过调节睡眠中枢的正常生理节律来调节OSAHS患者的REM期睡眠的。也有学者的研究结果证实了OSAHS患者的晨起血浆中VIP浓度与睡眠效率成正相关，即血中VIP浓度越高，REM期睡眠时间越长，浅睡及醒觉时间越减少，睡眠质量与效率就越高，提示VIP参与了OSAHS患者睡眠结构的调节[8]。OSAHS患者由于上气道解剖结构异常，软组织失去了正常的生理功能，导致患者睡眠时产生低通气从而引起低氧血症或者高碳酸血症，造成了机体内环境的紊乱，而VIP作为一种具有舒张血管作用的神经肽类物质，对咽部软组织由于缺氧而产生收缩以加强血流的小动脉或者小静脉具有显著作用，使其血管扩张和通透性增强，从而缓解局部的缺氧状态。但同时由于VIP的扩血管作用，在OSAHS患者的自主神经系统紊乱的大环境下，其含量的增高引起血管过度扩张，导致血管的超负荷灌注增加，造成局部组织的再灌注损伤和咽部组织的继发性肿胀，形成了缺氧→VIP增高→血管扩张，通透性增强→咽部组织肿胀→OSAHS发生→缺氧的恶性循环。这与前面提到的神经源性学说具有一致性，都为OSAHS患者存在高VIP血症鉴定了理论基础。

3.2 β－EP与OSAHS

β－内啡肽是一种具有与阿片类生物活性物质生物学作用的神经肽，在中枢神经系统内起着神经介质和神经内分泌的作用。由于其有较强的麻醉作用，能产生明显的心肺功能紊乱，包括心动过缓、低血压、呼吸抑制和呼吸暂停。有研究认为缺氧可直接作用于呼吸中枢的调节吸气的神经细胞，或间接作用于桥脑区等非呼吸神经中枢，引起β－EP的释放。实验研究表明，在低气压缺氧状态下能导致血浆β－EP水平增加，在重度低氧下，β－EP可能参与了成人低氧通气压抑的机制，并对外周低氧敏感性有抑制作用。动物实验中新生鼠缺氧缺血性脑损伤结果显示大脑皮层β－EP含量的升高与皮层水肿程度呈正相关。而缺氧缺血性脑病患儿血浆β－EP浓度明显高于对照组，提示β－EP参与了窒息后脑损伤的病理生理过程。国外有学者报道，婴儿呼吸暂停综合征及肥胖通气过低综合征小儿脑脊液中β－EP明显增高，认为β－EP的升高是呼吸暂停的应激反应。许多研究证明，肥胖与β－EP有着密切的关系，肥胖人血清β－EP水平明显增高，并与体重相关。肥胖小儿血中的β－EP含量是正常对照组的2倍，并且其分泌的节律性消失，始终维持在恒定的高水平状态[9]。其机制可能是低氧血症和高碳酸血症导致大脑中的呼吸中枢—延髓的呼吸神经元活性增强，而后间接作用与β－EP神经元高密度区，引起β－EP的产生和释放增加所致[10]。

本研究中β－EP的ELISA结果显示:OSAHS组患者血浆中β－EP为高表达，并且重度OSAHS组的表达明显高于对照组和轻中度OSAHS组，统计学结果支持重度OSAHS组与对照组，轻中度OSAHS组与对照组，轻中度OSAHS组与重度OSAHS组三者之间均有显著性差异(P＜0.01)。提示血浆中β－EP参与了OSAHS的疾病发生发展过程，随着AHI指数的增加，其血浆中的浓度也呈现增高趋势。可能是OSAHS患者低通气导致的低氧或高碳酸环境能够激活下丘脑→垂体→肾上腺轴，导致垂体前叶促肾上腺皮质激素细胞的合成和分泌功能增加，其合成和分泌的产物之一—前阿片素原的含量也相应增加，后者作为β－EP等肽类物质的前体，使血浆中的β－EP水平相应升高[11];反过来，血浆中的β－EP的含量增多可反馈性抑制大脑呼吸中枢—延髓的敏感性和主动脉窦、主动脉体化学感觉器对低氧和高碳酸血症的敏感性[12]，形成缺氧→β－EP升高→呼吸抑制→缺氧的恶性循环，继而可使患者表现为混合性睡眠呼吸暂停低通气综合征的病理变化。已有研究证实，肥胖患者血浆中的β－EP水平为高表达[13];而肥胖是OSAHS患者的重要的发病因素之一，本实验中对是否β－EP水平增高首先导致肥胖从而再导致OSAHS，未给予统计学证实，其机制还有待于进一步研究。

3.3 VIP和β－EP在OSAHS患者血浆中的表达的相关性

在OSAHS重度组中，VIP与β－EP的表达呈正相关，表明两者在OSAHS的发病过程中具有协同作用。联合检测二者可能对OSAHS的病因诊断及治疗效果的判断具有重要的理论和临床价值。

综上所述，OSAHS的病因和发病机制非常复杂，至今仍未得到完全证实。前人在分子生物学水平所做的众多研究都表明，生物活性因子在OSAHS的发生发展过程中都发挥了极其重要的作用。VIP和β－EP作为其中的两种神经肽类物质，即可以作为神经介质或激素单独发挥作用，也有可能共存于同一神经元中通过神经内分泌等各种途径发挥作用[14]。考虑在缺氧环境中两者间可能存在协同作用，其相互的作用关系还有待于进一步深入的研究，其结果必将有助于进一步阐明OSAHS的病因及发病机制，为临床治疗特别是重度患者的治疗(如采用神经肽受体拮抗剂治疗)提供新的思路和科学依据，具有重要的理论和实际价值。

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