蒋 猛，刘振辉，易成腊，白祥军

急性脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的病理生理过程主要由原发性机械性损伤和继发性炎症反应及氧化应激等损伤共同构成。多种因素参与了继发性脊髓损伤的病理过程，而且其后果往往比原发性损伤更为严重。在SCI急性期，局部产生大量兴奋性毒性氨基酸、氮氧化物、过度的炎症反应及自由基等，可造成严重的继发性神经损害。脊髓损伤后，释放的细胞因子可活化炎性细胞如中性粒细胞、巨噬细胞并促使其黏附、吞噬、脱颗粒、释放蛋白酶及氧自由基，破坏脊髓组织血管内皮的完整性，加重脊髓水肿、坏死，使神经功能恶化。继发的炎症反应严重阻碍脊髓损伤后的修复，表现为组织进行性坏死，持续细胞裂解及进展性病灶扩大［1］。

糖还原酶(Aldose reductase，AR)广泛存在于神经、肌肉、脑、肾脏、胎盘、血管、视网膜等组织胞浆中，正常组织内AR活性很低，但在全身炎性反应、肿瘤、晶状体炎症、心肌病、血管内皮损伤等患者发现AR含量增高，抑制其表达可以减轻炎症反应及组织损伤，减少细胞凋亡［2-6］。然而AR与脊髓损伤后继发炎症反应的相关性目前尚无文献记载，因此本实验拟通过大鼠的脊髓损伤模型探究AR在脊髓损伤前后的表达变化，观察其与脊髓损伤的相关性，以期为脊髓损伤修复治疗提供新的靶点。

材料与方法

1 材料

150只成年雄性SD大鼠(华中科技大学同济医学院动物中心提供，SPF级)，体重200～270g。随机分为假手术组(sham组，n=50)，脊髓损伤组(SCI组，n=50)和脊髓损伤+醛糖还原酶抑制剂(唐林，即依帕司他)干预组(ARI组，n=50)。SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德公司提供。RNA提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供。大鼠醛糖还原酶(AR)酶联免疫分析试剂盒由上海越研生物科技有限公司提供。大鼠醛糖还原酶抗体购自Bioworld科技有限公司。

2 脊髓损伤模型及分组

SCI组和ARI组动物模型制备方法如下:大鼠经10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉后固定在立体定向仪上，切除 T9、T10椎板，压迫 T9、T10脊髓，压迫重量为35g，时间为5min，造成中度胸髓损伤。Sham组只做T9、T10椎板切除术。ARI组在脊髓损伤后立即给予唐林(ARI)10mg/(kg·d)胃内灌注，Sham组和SCI组以相同方法给予等量生理盐水灌胃作为对照。术后软食饲养，定时排尿。

3 取材及切片制备

分别于术后 5 个时间点(3、12、24、48、72h)切取大鼠脊髓组织(每组每次各5只)。大鼠经10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔内麻醉后，采用心脏灌流法固定，切取以受伤节段为中心约8mm长的脊髓组织，用4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，备用。每组各时间点另取5只大鼠，断颈处死，切取以受伤节段为中心约8mm长的脊髓组织，每个脊髓组织均以受伤节段为中心横断为三等份，置于深低温冰箱-80℃保存。

4 组织切片

从各组术后相应时间点每只大鼠的切片中随机抽取5张，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察各组大鼠损伤脊髓组织炎症反应病理变化。

5 免疫组化

从各组术后各时间点每只大鼠的切片中随机抽取5张，进行免疫组织化学染色。以胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，计算每张切片的阳性细胞百分率。

6 双抗体夹心法测定AR含量

脊髓组织研磨，离心，取上清液测定AR蛋白浓度。参照空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即可得到AR含量。

7 RT-PCR法检测脊髓组织中AR mRNA表达

应用试剂盒提取各冷冻样本组织的总RNA，紫外线吸收法测定RNA纯度，变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA。应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物，以β-actin作为内参。参照试剂盒说明书逆转录合成cDNA，在ABI7900实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件:93℃ 2min预变性，然后按 93℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共做40个循环，最后72℃ 7min延伸。用2-△△ct法进行计算和统计比较各组AR mRNA real time PCR拷贝数的差异。

8 蛋白免疫印迹(Western-blot)检测脊髓组织AR含量

取出各组术后各时间点每只大鼠低温保存的脊髓组织，RIPA裂解液提取蛋白，测定蛋白浓度，电泳，转膜，显色。BandScan分析胶片灰度值，甘油酯-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，醛糖还原酶的表达强度为两者灰度的比值。

9 统计学处理

采用SPSS13.0统计分析软件进行处理，计量数据以¯x±s表示，两组间比较用方差分析的q检验(Student-Newman-Keuls，SNK)，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 组织病理学观察

病理切片HE染色光镜观察显示，sham组大鼠脊髓组织结构清晰，神经元形态完整，组织内未见出血、坏死及水肿、变性等表现。SCI组伤后3h伤段脊髓灰质内有小片状出血;伤后6h灰质中有弥漫性出血灶，灰质结构破坏，部分神经元死亡，可见核固缩，白质疏松水肿;伤后24h出血范围扩大，灰质中大量神经元死亡，核固缩，中心液化坏死，尼氏体溶解，白质中可见大量空泡;伤后48h灰质被明显破坏，损伤中心见坏死空腔形成，并可见炎性细胞浸润;伤后72h灰、白质结构破坏严重，组织液化形成空腔，边缘胶质细胞增生，并可见大量炎性细胞浸润。初始ARI组病理变化与SCI组接近，但随时间延长，伤后12、24h损伤区内其正常神经元数量多于SCI组;伤后48、72h损伤区内灰、白质结构破坏程度及空腔形成亦轻于SCI组，炎症细胞浸润不明显(图1)。

图1 3组术后不同时间点组织病理学改变(HE染色 ×100)(A.sham 组，B.SCI组，C.ARI组)

2 免疫组化结果

AR表达阳性细胞在脊髓前角、后角、中央管周围和白质中均有分布。根据其形态和分布规律推测主要为神经元和星形胶质细胞(图2)。

图2 3组术后各时间点脊髓细胞阳性表现(免疫组化 ×400)(A.sham 组，B.SCI组，C.ARI组)

3 AR含量比较

图3 表明，sham 组 3、12、24、48、72h 脊髓组织中醛糖还原酶含量分别为(10.75±0.47)U/L、(10.61 ±0.44)U/L、(10.62 ±0.55)U/L、(10.92 ±0.49)U/L、(10.57 ±0.52)U/L。与之相比，SCI组对应时间点醛糖还原酶含量显著增高(P＜0.01)，ARI组各时间点醛糖还原酶含量较SCI组亦有明显降低(P＜0.01)。

图3 Elisa检测各组不同时间点脊髓组织中醛糖还原酶(AR)的含量(SCI组和sham组相比:*P＜0.01;ARI组和SCI组相比:＊＊P＜0.01)

4 RT-PCR检测

实时荧光定量PCR结果表明AR mRNA在sham组、SCI组和ARI组中均有表达。以sham组为标准，在各个时间点SCI组和ARI组AR mRNA平均相对表达情况见图4。SCI组与sham组和ARI组相比，AR mRNA表达明显升高(P＜0.01)。ARI组与sham组相比没有显著差别(P＞0.05)(图4)。

图4 以Sham组为标准不同时间点AR mRNA real time PCR 2-△△ct值(SCI组和 sham 组相比:*P ＜0.01;ARI组和SCI组相比:＊＊P＜0.01)

5 Western-blot结果

Western-blot结果显示，SCI组各个时间点AR的相对平均含量显著高于sham组和ARI组(P＜0.01)，ARI组和sham组没有显著差异(P＞0.05)(图5)。

图5 a.Western blot检测各组AR蛋白在大鼠脊髓中相对含量(1、2、3、4、5、6、7 分别为 sham 组 3h、SCI组 3h、24h、72h、ARI组 3h、24h、72h);b.BandScan 分析各组胶片灰度值(AR在各组的相对含量;SCI组和sham组相比:*P＜0.01;ARI组和SCI组相比:＊＊P＜0.01)

讨 论

本实验通过改良Allen法制备大鼠脊髓压伤模型，并运用免疫组化及分子生物学技术检测了脊髓损伤后病灶内AR表达变化及其上游RNA表达情况。结果表明脊髓损伤后局部醛糖还原酶RNA转录及蛋白表达明显增加，与脊髓损伤的程度有一定的相关性;并且运用醛糖还原酶抑制剂(ARI)可在一定程度上改善脊髓损伤继发的病理生理过程，提示AR可能在SCI后的继发性损伤中发挥了重要作用。

La Rosa等［7］认为SCI后局部产生大量活性氮氧化物及自由基造成起氧化应激，加上过度炎症反应，对损伤组织造成严重“二次打击”。局部产生的细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，可以增强核转录因子-kB(NF-kB)的表达，而它反过来又进一步刺激上述细胞因子的释放，形成正反馈恶性循环。而抑制NF-kB的活化可以减轻脊髓损伤后的炎症反应。目前已公认的糖皮质激素在SCI急性期对受伤脊髓的有益作用也证实了炎症反应在急性SCI中的作用。已有研究表明，AR可介导线粒体膜通透性增加并释放大量活性氧，在心肌缺血再灌注损伤过程中起到重要作用［8］。因此我们认为AR在SCI继发性损伤中的作用可能与其介导的氧化应激及炎症反应有关。

此外，本实验中用到的唐林(依帕司他)是目前已经上市的AR抑制剂，主要用于糖尿病相关神经并发症的治疗，可以改善运动和感觉神经传导速度和自觉神经症状，且耐受性好［9］。该药或许可以用于SCI急性期的治疗，但需要进一步严格设计的动物实验及临床试验加以证实。

综上所述，我们发现脊髓损伤后局部AR表达显著升高，其变化与脊髓损伤成一定程度正相关，提示AR可能是脊髓继发性损伤的因素之一。组织病理学结果显示利用AR抑制剂可减少脊髓损伤局部的炎症反应，其机制可能通过抑制氧化应激及自由基损伤、减少炎症反应等途径，尚有待研究。

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［2］ Srivastava SK，Yadav UC，Reddy AB，et al.Aldose reductase inhibition suppresses oxidative stress-induced inflammatory disorders［J］.Chem Biol Interact，2011，191(1-3):330-338.

［3］ Ramana KV，Friedrich B，Bhatnagar A，et al.Aldose reductase mediates cytotoxic signals of hyperglycemia and TNF-alpha in human lens epithelial cells［J］.FASEB J，2003，17(2):315-317.

［4］ Ramana KV，Bhatnagar A，Srivastava SK.Aldose reductase regulates TNF-alpha-induced cell signaling and apoptosis in vascular endothelial cells［J］.FEBS Lett，2004，570(1-3):189-194.

［5］ Tammali R，Ramana KV，Srivastava SK.Aldose reductase regulates TNF-alpha-induced PGE2 production in human colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2007，252(2):299-306.

［6］ Ramana KV，Willis MS，White MD，et al.Endotoxin-induced cardiomyopathy and systemic inflammation in mice is prevented by aldose reductase inhibition［J］.Circulation，2006，114(17):1838-1846.

［7］ La Rosa G，Cardali S，Genovese T，et al.Inhibition of the nuclear factor-kappaB activation with pyrrolidine dithiocarbamate attenuating inflammation and oxidative stress after experimental spinal cord trauma in rats［J］.J Neurosurg Spine，2004，1(3):311-321.

［8］ Ananthakrishnan R，Kaneko M，Hwang YC，et al.Aldose reductase mediates myocardial ischemia-reperfusion injury in part by opening mitochondrial permeability transition pore［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(2):H333-341.

［9］ Sharma SR，Sharma N.Epalrestat，an aldose reductase inhibitor，in diabetic neuropathy:an Indian perspective［J］.Ann Indian Acad Neurol，2008，11(4):231-235.