方义亮，高 博，王宇平，肖 武，张建庆，王光辉，凌飞跃

蚊类是动物界昆虫纲双翅目的重要组成成员，其形态多样，种类繁多，目前全世界已知共有40属3 500多种（亚种）［1］，在我国就有21属387多种（亚种）［2］，与人类关系密切，其中中华按蚊、雷氏按蚊（曾名为嗜人按蚊）［3］、大劣按蚊、微小按蚊、淡色库蚊、致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、骚扰阿蚊等除了可骚扰刺吸外，还可传播疟疾、丝虫病、流行性乙型脑炎、登革热／登革出血热、黄热病、西尼罗热、基孔肯亚热等80多种疾病。因为媒介蚊类的医学重要性，对其鉴定与识别成为监测与控制疾病发生与传播的基础，同时也是疾病预防与控制、国境卫生检疫的核心环节。本文就蚊类形态鉴定方法、DNA条形码技术及其在蚊类鉴定上的应用进行综述，以期对蚊传疾病的预防和控制、卫生检疫有所帮助。

1 传统媒介生物鉴定方法

目前口岸媒介生物的传统鉴定方法为形态学鉴定方法，主要是依靠有形态学鉴定经验、具有媒介生物形态鉴定知识的实验室专业人员根据医学媒介分类检索表进行种类鉴定。整个鉴定过程大致需要数周的时间，对于截获的卵、幼虫和蛹，由于鉴定特征细微难辨，往往需要培养至成虫再鉴定，如果是少见的国外种类，还要请国外专家协助鉴定，鉴定所需的时间就更多了。例如2009年福建出入境检验检疫局在菲律宾入境的船舶“美达108”上先后截获两批埃及伊蚊幼虫，从截获到饲养至成蚊整个过程需10d。

受限于鉴定人员的经验积累、专业要求、标本完整性与发育阶段，传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题。口岸有害生物媒介检疫除了进一步提高检疫人员鉴定能力，研制开发鉴定辅助系统（如医学媒介生物远程鉴定系统）外，仍需要发展各种安全、快速、准确、灵敏、高通量的检疫鉴定技术体系，以达到快速鉴定、风险分析、及时预警、有效控制的目标。

2 新型媒介蚊类鉴定方法的形成

新型媒介生物鉴定方法是有别于形态学鉴定方法，不受限于形态表型特征，而是以媒介生物核酸碱基排列顺序为基础的数字化鉴定方法。新型媒介蚊类鉴定方法是伴随着蚊虫分类学发展而发展的。1758年，瑞典自然学者林奈用双名法命名尖音库蚊，标识着以外部形态为依据的蚊类传统分类体系的建立。由于蚊虫分类系统中存在大量的复合组（体）、种团和近缘种，蚊虫分类学发展陷入困境。20世纪50年代细胞遗传方法的引入，澄清了五斑按蚊复合组（Anopeles muculipennis Complex）、冈比亚按蚊复合组（An．gombiae Complex）和赫坎按蚊种团（An．hyrcanus Group）等近缘种分类问题，使蚊虫分类进入了细胞水平。由于取材技术方面的困难，细胞遗传技术使用范围受限，到20世纪60－70年代，蚊虫分类引入酶谱学技术，并且应用遗传距离概念描述同工酶等位基因频率的变化，蚊虫分类学进入蛋白质分子水平，蚊虫分子分类学初步形成。之后气相色谱分析技术、重组DNA技术也应用到蚊虫分子分类中来。近20年来，随着分子生物学新技术如RAPD、PCR－SSCP和AFLP等的发展，多种分子标识如微卫星、线粒体基因（COⅠ、COⅡ等）和核糖体基因（ITS）的引入，蚊虫分子鉴定技术获得突飞猛进的发展［4－6］，至此，为新型的蚊类鉴定技术出现奠定了坚实的基础，一种别于传统的形态学鉴定技术，基于机体的核酸碱基排列顺序的鉴定技术应运而生。

3 DNA条形码

条形码（barcoding）多见于日常生活中的商品上，由规则排列的条、空符号和数字表示每一件商品的信息，节省识别商品信息的时间，提高销售效率。同样的道理，DNA条形码技术指的是通过特定DNA片段的核酸序列代表特定生物信息，达到识别生物的目的。该概念是在分子生物学和信息技术发展的基础上，由加拿大生物学家 Hebert［7］首先提出，因其有不受发育阶段影响、不受个体形态特征影响、不受物种的限制、可以鉴定出群体中的隐存分类单元、获取信息量大、精确性高、操作简便且高效等优点使得DNA条形码技术受到分类鉴定工作者的普遍欢迎，并迅速发展成为学科前沿之一［8］。

DNA条形码是标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的特定DNA片段，其选择标准一般为［9］：1、片段尽量短，一般不超过700bp，两端包含保守区域，能为通用引物所扩增。2、具有足够的变异信息区分不同的物种。不同的物种和不同的研究需要所选择的DNA条形码不同，不同物种的识别有时需要不同DNA条形码。鉴于此目前运用于媒介蚊类的DNA条形码主要有核糖体基因rDNA片段（ITS、IGS、5．8s，28s、18s）、线粒体基因 mtDNA片段（COI、COII、ND4、ND5、Ctyb、控制区D）。

4 DNA条形码在蚊媒鉴定以及系统发育的应用

核糖体基因（rDNA）由rRNA的重复串联单位组成，每一单位5′－3′包含如下几个区段：1）非转录区NTS；2）外转录间隔区ETS；3）18SrDNA；4）内转录间隔区1ITS1；5）5．8SrDNA；6）内转录间隔区2ITS2；7）28SrDNA。ITS序列分别位于18SrDNA和28SrDNA之间，被5．8SrDNA分成两个部分（ITS1、ITS2），而这几部分组成了一个重复单位。两个重复单位间隔区为IGS。在基因组中属于高度重复序列，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间可发生位点内或位点间的同步进化（concerted evolution），这就为PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础［10］。而由于rDNA的保守区域较多，便于引物设计，同时不同区域进化水平不同，可用于不同分类等级的研究，所以基于rDNA的条形码技术广泛应用于昆虫系统发育与区系研究［11］。

ITS1、ITS2 分别位于18S－5．8SrDNA、5．8S－28SrDNA之间，而18S、5．8S、28SrDNA 序列非常保守，有利于引物的设计，可用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序，另外ITS变异速度较快，能够提供较丰富的变异位点和信息位点，所以ITS适合作为DNA条形码的目的DNA片段。基于rDNA－ITS2条形码技术进行种团、复合体之间进行鉴定，在发现隐种和种团内鉴定起到了重要的作用。史慧勤等［12］，对云南、海南、广西以及泰国4个不同地区7个不同地理株微小按蚊rDNA－ITS2条形码进行比较，发现微小按蚊存在A、C两型（373～375bp，GC%＝55．76～56．03%），替换11处、颠换13处，缺失／插入2处，地理株内个体间rDNA－ITS2序列的差异很小或无。与近缘种相比，微小按蚊ITS2片段的GC含量与Van Bortel等［13］和 Manonmai等［14］研究发现的按蚊（55．56%）、瓦容按蚊（54．56%）、溪流按蚊（54．96%～55．50%）相接近。马雅军等［15］利用rDNA－ITS2对我国多斑按蚊复合体5成员种经PCR后进行鉴别，伪威氏按蚊（328bp、GC 58．54%、多 斑 按 蚊 （330bp、GC 57．85%），威氏按蚊（337bp、GC 59．05%），达罗毗按蚊（334bp、GC 58．68%），塞沃按蚊（338bp、GC 57．69%），各种内的ITS2序列保守，而种间的差异率范围为9．7%～18．9% 。同期马雅军等［16］又对赫坎按蚊种团成员进行鉴定，ITS2片段468～436 bp，GC% ＝44．9% ～46．8%，种 内 差 异 0% ～3．8%，种间差异9．0%～32．3%，种内差异小于种间差异。rDNA－ITS2条形码在蚊媒种内变异很小，而种间差异较大，适合作为近缘种的识别与鉴定。

表1 核酸序列各区域应用范围［11］Tab．1 Application regional scope of nucleic acid sequence

线粒体DNA（mtDNA）广泛存在于昆虫体内，其大小一般约为15．4～16．3kb，封闭环状双链，其中含有编码2个核糖体RNA（12SrRNA，16SrRNA）、22个tRNA、线粒体内膜蛋白质多聚体的12个亚基（3个细胞素氧化酶COI、COII、COIII，1个细胞色素b，6个NADH讲解酶ND1～6和2个ATP酶6和8），核酸序列和组成较保守，以其作为模板制作的PCR反应引物的通用性比较强。同时，mtDNA基因组不含间隔区和内含子，无重复序列不等交换，在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变，严格遵守母系遗传的方式。由于有这些结构和进化上的特点，基于mtDNA条形码技术在国外逐渐被运用于蚊虫物种鉴定、系统进化关系的研究［17－20］，国内也有不少的学者关注。王冬等［21］应用mtDNA－COI条形码特征阐明我国大劣按蚊A、D群体的遗传差异和分化水平。李石柱等［22］等测定并比较分析多斑按蚊复合体5成员种mtDNACOⅡ条形码（684bp，GC 24．85%～26．02%），显示种内差异0．15%～0．58%，种间差异较大（3．66%～9．63%）。宋社吾等［23］通过测定我国尖音库蚊复合组4亚种、三带喙库蚊、白纹伊蚊和中华按蚊mtDNA－16srRNA条码，发现尖音库蚊复合组4亚种 mtDNA－16srRNA条码基本一致（554bp，GC 25．41%），不同种间存在差异，与三带喙库蚊0．54%、与白纹伊蚊5．77%，与中华按蚊9．62%，表明 mtDNA－16srRNA条码种内十分保守，难以反映亚种阶元，但可以用于种间鉴别。

5 DNA条形码技术的发展趋势

目前，DNA条形码已成为生物分类和鉴定的新方向，是生物学领域发展最迅速的学科前沿之一，在物种鉴定方面具有广阔的应用前景。我们的世界拥有数量庞大、种类繁多的动植物，而每一个物种都是极其珍贵的资源。大量的事实证明，DNA条形码技术是一个方便高效的物种鉴定方法，不但是传统生物鉴定强有力的补充，而且由于其融入了数字化手段，使样品在鉴定过程中实现了自动化和标准化，突破了传统经验的束缚。DNA条形码技术的发展方向主要有微型DNA条形码鉴定技术和DNA条形码芯片技术。

5．1 微型DNA条形码鉴定技术 微型DNA条形码技术是基于DNA条形码技术发展起来的新方法，其要求的基因序列碱基长度比DNA条形码要求更短，一般为100～150bp［24－25］，有效地解决了陈旧标本因核酸片段不容易提取而造成鉴定困难的难题。目前已经应用到鱼类［26］、蛤蚧［27］、实蝇［28］等物种鉴定上。

5．2 DNA条形码芯片技术 DNA芯片技术的原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，以此来准确鉴定物种。由于该技术能够同时将大量探针固定于支持物上，可以实现一次性对样品大量序列进行检测和分析，具有操作简便、自动化程度高、操作序列数量多、检测效率高等优势，目前在检验检疫领域已开始有所探索［29－31］。

6 结 语

DNA条形码技术作为新兴的技术，是传统形态学鉴定的重要补充，其发展和成熟有赖于条形码技术的规范和统一，另外更重要的是需要条形码库的进一步完善和补充，而这中间将有一段很长的路需要继续探索。

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