贾引军，熊小路，王锡乐，齐 永，焦 俊，段长松，龚文平，温博海

普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）是流行性斑疹伤寒的病原体，普氏立克次体引起的疾病称为流行性斑疹伤寒（epidemic typhus）。流行性斑疹伤寒是一种急性传染病，其临床主要特征为起病急、持续高热和瘀点样皮疹，常伴有剧烈头痛、背痛，严重病人多有中枢神经系统损伤症状。流行性斑疹伤寒的传播媒介为体虱，故该病又称虱传斑疹伤寒（louse－borne typhus）。在战争、灾荒或其它卫生情况差的情况下，虱极易繁衍和在集团人群中移动，特别容易引起流行性斑疹伤寒的暴发，故该病在战争时发生称为战争热（war fever）。第一次世界大战，普氏立克次体感染2～3千万人，引起数百万人死亡。近数十年来，随着大规模战争的消失、人民生活和卫生条件的改善，未出现流行性斑疹伤寒的大规模流行。但是，局部战争和灾荒仍使得流行性斑疹伤寒在某些国家流行，只要人群中有虱的寄生，流行性斑疹伤寒发生的可能性就存在［1］。

快速确诊可能出现的普氏立克次体感染是有效防控流行性斑疹伤寒的关键。目前，流行性斑疹伤寒的诊断主要依赖普氏立克次体全菌抗原做间接免疫荧光（IFA）血清学分析。普氏立克次体全菌抗原的制备步骤繁杂，并且需要高水平的生物安全设备；另外IFA的不同立克次体种属菌体之间的血清学交叉反应也影响其诊断的可靠性［2－3］。因此，发现普氏立克次体特异性抗原代替全菌抗原做斑疹伤寒的血清学诊断很有必要［4］。依据已发表的普氏立克次体全基因序列和鉴定的普氏立克次体主要蛋白抗原［5－8］，结合生物信息学分析，我们选择8个预测抗原性较强的普氏立克次体蛋白抗原分子作为候选诊断抗原。本研究采用分子克隆方法制备出这8个抗原的重组蛋白，并用免疫印迹分析这些重组蛋白，筛选与普氏立克次体感染血清特异反应的蛋白分子作为流行性斑疹伤寒血清学诊断的候选抗原。

1 材料与方法

1．1 立克次体菌株与实验感染小鼠血清 普氏立克次体（E株）、莫氏立克次体（Wilmington株）、立氏立克次体（Sheila Smith株）、黑龙江立克次体（054株）、恙虫病东方体（Gilliam株）、贝氏柯克斯体（新桥株）等立克次体菌株为军事医学科学院微生物流行病研究所立克次体学专业实验室保存。用Vero细胞感染的方法对黑龙江立克次体和立氏立克次体进行传代和保种［9］，其余的立克次体用7日龄鸡胚接种的方法进行传代、保种［10］。用以上立克次体分别腹腔接种6周龄BALB／c小鼠，每只接种107菌；感染4周后活杀小鼠取血，分离血清－20℃冻存备用［9－10］。将每种立克次体感染小鼠血清5份混合，将混合血清用相应的立克次体抗原片按常规方法做间接免疫荧光［11］，测得普氏立克次体感染小鼠血清效价为1∶640，莫氏立克次体为1∶640，立氏立克次体为1∶1 280，黑龙江立克次体为1∶1 280，恙虫病东方体为1∶320，贝氏柯克斯体为2560。做免疫印迹时，每种血清按其间接免疫荧光抗体效价的1／10稀释；5份正常小鼠血清混合后做1∶50稀释。

1．2 试剂与材料 引物为生工生物工程（上海）有限公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶试剂为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA提取试剂盒为德国QIAGEN产品；PCR产物回收试剂盒为Bio Basic Inc产品；DNA胶回收试剂盒为OMEGA产品；质粒提取试剂盒、DL－2000Marker、低分子量蛋白Marker等为中科瑞泰（北京）生物科技有限公司产品；HRP标记羊抗小鼠IgG为北京思语伟业公司产品；DAB显色试剂盒为武汉博士德公司产品。

1．3 普氏立克次体主要的蛋白抗原基因 结合文献报告［12－14］的普氏立克次体主要蛋白抗原，从普氏立克次体E株的全基因组序列（序列号：NC＿000963）中找出相应基因，同时用DNA Star软件中的Protean程序预测蛋白的抗原指数及指标［15］其中包括亲水性、电荷分布等因素，从而筛选出抗原性较强的8个主要抗原基因（sca5、ftsZ、groEL、omp、rp828、tolC、tsf、tuf）。

1．4 目的基因的扩增 用Primer5．0软件设计8个目的基因扩增引物，引物设计的基本原则为保留预测到的主要抗原区；其中sca5由于长度超过2 000bp，将其分成两段（sca5－1和sca5－2）设计对引物进行PCR扩增；引物中加入与质粒pET－32a相应的酶切和连接位点（表1）。目的基因产物扩增采用50μL反应体系，普氏立克次体DNA模板2 μL（40ng／μL），上下游引物各1μL（20μmol／L），Taq DNA 聚合酶1．25u，dNTP Mixture 2μL，PCR Buffer 5μL；扩增条件为95℃ 预变性5min，然后以95℃ 变性30s、55℃ 退火30s、72℃延伸1min循环35次，最后72℃延伸5min。将扩增产物做1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳完后将凝胶上的目的DNA带切下，再用凝胶DNA回收试盒分离纯化扩增的基因片段。

1．5 重组蛋白制备 将扩增好的目的基因和pET－32a质粒分别用相应的内切酶进行酶切。将回收的酶切目的基因与相应的质粒按常规条件进行连接，构建重组质粒。依据常规方法将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞［16］。在含氨苄青霉素的LB固体培养基上接种转化菌，用PCR及酶切鉴定带有目的基因重组质粒的转化菌。按常规方法用IPTG诱导生长在含有氨苄青霉素的LB液体培养基的转化菌表达重组蛋白；诱导表达后加入样本液裂解转化菌，然后对裂解样本做聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析，鉴定转化菌表达的目的蛋白。对表达目的蛋白的转化菌在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中IPTG诱导生长，按Qiagen公司的Ni－NTA纯化试剂盒说明书表达的重组蛋白进行分离纯化。

表1 普氏立克次体主要抗原基因的PCR扩增引物Tab．1 Primer－pairs of genes encoding major antigens of R．prowazekii

1．6 对重组蛋白抗原进行免疫印迹分析 用纯化后的重组蛋白10μL（0．8mg／mL）加入等量的2×SDS上样缓冲液煮沸5min进行SDS－PAGE电泳，采用半干电转印法将电泳分离后纯化重组蛋白转移到硝酸纤维（PVDF）膜上。感染血清使用前先和超声裂解pET－32a质粒转化菌在室温下中和2h，以去除血清中与大肠杆菌非特异性反应抗体。将血清用含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液稀释，稀释比例为IFA检测效价的1／10倍。将稀释后血清与载有重组蛋白的PVDF膜室温作用1h，用PBST（含有0．05%吐温的PBS缓冲液）洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（1∶2 000）室温反应1h，然后经过3次PBST洗涤后以DAB显色试剂盒显色。

2 结 果

2．1 重组目的蛋白的原核细胞表达 将9对PCR扩增引物分别作PCR，得到了相应的DNA片段与预期大小相符合。将目的基因片段插入原核表达质粒构建相应的重组菌。在IPTG的诱导下9个重组菌中均表达目的蛋白（图1）。采用Ni－NTA对表达的重组蛋白进行亲和纯化，SDS－PAGE分析确认获得分子量与设计大小一致的重组目的蛋白（图2）。

图1 SDS－PAGE分析重组菌表达目的蛋白Fig．1 Analysis of the expressed target proteins by SDS－PAGE

2．2 免疫印迹分析重组蛋白 将6种立克次体感染小鼠血清与9个重组蛋白抗原做免疫印迹，普氏立克次体感染血清除与TolC反应阴性外，与其它8个蛋白反应阳性；莫氏立克次体感染小鼠血清与Sca5－1、Sca5－2、Omp、EF－Tu等4个蛋白反应阳性；贝氏柯克斯体感染血清与Sca5－1、Sca5－2、EF－Tu等3个蛋白反应阳性；恙虫病东方体感染血清与Sca5－1反应阳性；立氏立克次体感染血清反应与Sca5－1和EF－Tu反应阳性；黑龙江立克次体感染血清不与任何蛋白反应（表2、图3）。

图2 SDS－PAGE电泳分析纯化重组蛋白Fig．2 Analysis of the purified recombinant proteins by SDSPAGE

3 讨 论

依据已发表的普氏立克次体全基因序列和鉴定的普氏立克次体主要蛋白抗原，结合生物信息学分析，选择 Sca5、FtsZ、Omp、GroEL、Rp828、TolC、EF－Ts、EF－Tu等8个预测抗原性较强的普氏立克次体蛋白抗原分子，作为流行性斑疹伤寒候选诊断抗原。根据普氏立克次体E株的全基因序列分析及其注释发现：Sca5和Omp为普氏立克次体的表面蛋白；GroEL为60kD热休克蛋白，为分子伴侣、对蛋白的折叠起作用［17］；TolC是膜表面的通道蛋白；EF－Ts和EF－Tu为DNA复制的延伸因子，在立克次体入侵中为GTP水解提供能量；FtsZ可能与立克次体的分裂调控有密切关系；Rp828推测可能是一种与宿主细胞表面相互作用的蛋白。这些蛋白均可呈现在菌体表面，为普氏立克次体的主要表面抗原。我们采用分子克隆技术研制出与其相应的9个重组蛋白（其中Sca5分子大，制备2个重组蛋白Sca5－1和Sca5－2）。用普氏立克次体等6种立克次体感染小鼠血清与这9个重组蛋白抗原做免疫印迹，分析重组蛋白抗原的血清学反应特异性。

图3 立克次体感染小鼠血清免疫印迹分析普氏立克次体重组蛋白抗原Fig．3 Analysis of the recombinant protein antigens by immunoblot assay with sera from mice infected with rickettsiaeLane 1：Sca5－1；2：Sca5－2；3：FtsZ；4：GroEL；5：Omp；6：Rp828；7：TolC；8：EF－Ts；9：EF－Tu．A：Sera from mice infected with R．prowazekii；B：Sera from mice infected with R．mooseri；C：Sera from mice infected with R．rickettsii；D：Sera from mice infected with R．heilongjiangensis；E：Sera from mice infected with Orientia tsutsugamushi；F：Sera from mice infected with C．burnetii；G：Sera from normal mice．

表2 免疫印迹分析普氏立克次体重组蛋白抗原Tab．2 Immunoblotting of the recombinant protein antigens of R．prowazekii

结果显示FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4个蛋白特异性最好，仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应，因此FtsZ、GroEL、EF－Ts、Rp828等4个蛋白抗原可以认作普氏立克次体特异性抗原。其次是Omp，它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外，仅与莫氏立克次体感染血清反应。莫氏立克次体与普氏立克次体有最密切的亲缘关系，用全菌抗原对其感染动物或患者血清做IFA时，呈现严重的血清学交叉。如果采用这些普氏立克次体特异性蛋白抗原做血清学检测（如ELISA或蛋白芯片分析）将有可能很好的区分普氏立克次体与莫氏立克次体感染。本研究仅仅是采用实验感染动物血清对这些普氏立克次体重组蛋白抗原特异性进行了分析，仍需要采用相应感染患者血清对其做进一步分析，以明确其在斑疹伤寒血清学诊断中的应用价值。

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