王雪瑶，潘润洲，鲁 曦，郭姝奇，闫亚欣，李 欣

(1.承德医学院2010级临床本科，河北承德 067000;2.指导教师)

膜联蛋白(ANXA)是一个Ca2＋依赖的磷脂结合蛋白家族，结构上，它们都有C端保守的核心区域，N端序列中有磷脂酶A2(PLA2)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点。功能上，在Ca2＋存在的条件下，它们可与细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)可逆性地结合。PKC是胞外细胞信号转导通路的重要成分，若过度激活会造成细胞增殖失调，佛波脂(PMC)是PKC的激动剂，可持续激活PKC而引起肿瘤的发生。ANXA5由于其N端缺乏PKC结合位点而不能成为PKC的底物，同时ANXA5还是PKC的抑制剂，这注定了ANXA5与肿瘤的发生必定有着某些联系，有研究表明，ANXA5与细胞凋亡密切相关。为了更深入地研究ANXA5在肿瘤中的作用，我们选择宫颈癌细胞系SiHa，构建ANXA5重组质粒并进行转染，对比观察ANXA5过表达对SiHa细胞形态的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 pcDNA3.1质粒的大肠杆菌，细胞培养基(DMEM)，SiHa细胞，显微镜。

1.2 细胞培养 SiHa细胞培养于含10%小牛血清和2g/LNaHCO3的DMEM中，置于37.5%CO2的孵箱中，隔天换液一次，待细胞达到对数生长期和90%密度时，取细胞进行实验。

1.3 构建ANXA5的重组质粒 大量扩增含pcDNA3.1质粒的大肠杆菌，抽质粒后用BamHI和XhoI进行酶切，获得带有BamHI和XhoI酶切位点的粘性末端的空质粒载体;设计膜联蛋白A5的引物，正向引物含BamHI酶切位点，反向引物含XhoI酶切位点，扩增含有膜联蛋白A5质粒的大肠杆菌，抽质粒后以此质粒为模板，PCR扩增出与pcDNA3.1空质粒带有相同酶切位点的膜联蛋白A5基因。用T4连接酶将pcDNA3.1空质粒与膜联蛋白A5基因相连，连接产物转化感受态大肠杆菌，涂板，挑克隆，摇菌抽质粒后酶切鉴定含膜联蛋白A5基因的克隆，大量扩增该克隆菌后抽质粒，得到pcDNA3.1-ANXA5重组质粒。……