王 涛 马晓静 李春梅 张兴华 (山东大学附属省立医院心内科，山东 济南 250021)

冠状动脉粥样硬化是作为冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的基本病变，而冠状动脉钙化(CAC)则是其标志和早期征象之一，检测CAC并作分析，对于发现冠状动脉粥样硬化的存在，并在一定范围内提示硬化程度有着重要临床意义〔1〕。visfatin是Fukuhara等〔2〕于2005年发现的一种新的脂肪因子，能发挥类似于胰岛素的作用，降低血糖〔3〕;并能促进脂肪细胞的合成和储积〔4〕。目前关于visfatin基因多态性的研究尚少。本研究拟观察血清visfatin浓度及 rs61330082与rs2058539基因位点在山东省汉族人群当中是否存在遗传变异，及与CAC的发病是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 实验组:选择2010年9月至2012年3月期间于山东省立医院心血管中心住院患者且经冠状动脉造影检查明确诊断为CAC共138例患者，均为汉族人群，相互间无血缘关系。MCG:男，40例，女26例，共66例，平均年龄(60.78±9.31)岁;MSCG:男，45例，女 27例，共 72例，平均年龄(65.98±12.87)岁。排除标准:①糖尿病;②近1个月内出现急慢性感染;③3个月内外科手术，创伤;④慢性结缔组织病及心脏瓣膜等疾病患者;⑤肿瘤;⑥严重肝肾功能不全。冠状动脉造影方法:采用经右股动脉Judkins方法，每一支血管至少有2个以上体位投影，结果由多年从事介入治疗的有经验的主任医师判断。CAC的诊断标准:根据钙化的严重程度，可分为以下4级〔5〕:无钙化:未发现任何阴影;轻度钙化:只有在心脏跳动时看到很轻，模糊的跳动的阴影，心脏不跳动时完全看不到阴影的存在;中度钙化:在心脏跳动时看到较清楚、较容易看到的阴影;心脏不动时看不到阴影的存在;重度钙化:在心脏跳动和不动时均可清楚地看到阴影的存在。对照组:68例均行冠状动脉造影检查，检查方法同上，排除CAC，及冠状动脉粥样硬化且肝肾功能、心脏彩超及心电图均正常。男40例，女28例，平均年龄(64.73±9.98)岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 PCR热循环仪(Applied Biosystems9700型基因扩增仪);图像分析仪(AlphalmagerTm2200);低温高速离心机(美国基因有限公司);电泳仪(北京六一仪器厂)人类基因组DNA提取盒(TIANGEN)，限制性内切酶(Fermentas及 NEB)。

1.2.2 标本采集及DNA的提取 所试对象均为冠脉造影术后明确诊断患者，均禁食12 h，过夜后于次日清晨空腹抽取静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，取全血2 ml用人类基因组DNA提取试剂盒提取外周静脉血白细胞，严格按照血液基因组DNA提取试剂盒要求提取DNA，提取DNA于－80℃冰箱冻存，剩余全血于离心机3 000 r/min，离心10 min后取上清，于－80℃冰箱冻存，以检测血清visfatin的浓度。

1.2.3 血清visfatin浓度的测定 血清visfatin检测选用Blue-Gene公司提供visfatin检测试剂盒，采用酶联免疫法(ELISA)进行visfatin的检测，严格按照说明书进行操作，由Alisei全自动酶免疫分析系统分析。

1.2.4 目的基因扩增(PCR反应) 引物通过生工生物工程(上海)有限公司设计并合成，rs61330082位点上游引物:CCGGTAAAACACAGGGAAGAT， 下 游 引 物:ATTCTATCTGGGGGCAGTGAT。rs2058539位点上游引物 TTAACTTTGGTATTCTTGCCACT，下 游 引 物 CAAAAATCCCCCAATTTCTGT。PCR 反应条件:反应体系均为 50 μl，上下游引物各 1 μl，Taq 酶0.25 μl;10 × pcr Buffer 5 μl模板 DNA1 μl，ddH2O 补充体积至50 μl。循环参数:95℃预变性5 min后，进入主循环(94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)×35 个循环，72℃终末循环5 min，置4℃终止反应。取5 μl的PCR反应产物与1 μl上样缓冲液在与1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得产物长度分别为 344 bp，273 bp。见图 1。

1.2.5 酶切反应 PCR产物体系30 μl酶切体系，限制性内切酶 MvaI 1.0 μl;10 × FastDigest Green Buffer 2.0 μl;rs66130058位点 PCR 产物 10 μl;ddH2O 17 μl补充体积至30 μl，离心均匀后，置37℃水浴充分酶解10 min。限制性内切酶 HphI 0.5 μl;10 × NEB 缓冲液 2.0 μl;rs2058539 位点 PCR产物 10 μl;ddH2O7.5 μl补充体积至 20 μl，离心均匀后，置37℃水浴充分酶解20 min。

1.2.6 酶切产物鉴定 取6 μl已含上样缓冲液的PCR产物，加入2%琼脂糖凝胶加样孔中，以DNA marker为参照。于110 W电压电泳后，在凝胶成像仪下观察基因并照相。见图2～图5。

1.2.7 生化指标 全自动生化分析仪检测血脂，血糖，C-反应蛋白等。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料均以±s表示，单本均数比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。所有显著性检验均采用双侧检验。

图1 visfatin基因不同位点PCR产物

图2 visfatin基因rs61330082位点CT型

图3 visfatin基因rs2058539、rs61330082位点CC、TT型

图4 visfatin基因rs20585391位点AA型

2 结果

2.1 各组临床资料比较 年龄、性别、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、C-反应蛋白相比较均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组血清Visfatin浓度的比较 MSCG患者的血清visfatin显著高于 CCNCG〔(32.33±9.45)vs(25.48±3.28)ng/ml，P＜0.01〕。MSCG患者的血清 visfatin水平显著高于 MCG〔(26.12±0.57)ng/ml，P＜0.01〕，MCG 与 CCNCG 无显著差异(P＞0.05)。

2.3 两个基因位点基因型分布和等位基因频率比较 基因位点rs61330082的基因型频率及等位基因频率分布有显著性差异(P＜0.01)而rs2058539的基因频率及等位基因频率分布无显著性差异(P＞0.05);位点rs61330082的T等位基因突变频率显示，T等位基因在CCNCG，MCG及MSCG是逐渐降低的趋势。见表2，表3。

图5 visfatin基因rs61330082位点CC型

表1 一般临床资料比较(±s)

表1 一般临床资料比较(±s)

一般临床资料CCNCG MCG MSCG性别(男/女) 68(40/28) 66(40/26) 72(45/27)年龄(岁) 64.73±9.98 60.78±9.31 65.98±12.87 FBG(mmol/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08 LDL-C(mmol/L) 2.76±0.78 2.96±1.37 2.56±0.98 HDL-C(mmol/L) 1.07±0.54 1.10±0.36 0.97±0.85 TG(mmol/L) 1.17±0.45 1.92±0.83 1.97±0.97 C-反应蛋白(mg/L) 5.62±3.28 5.78±6.34 5.68±7.08尿素氮(mmol/L)5.26±1.78 6.25±0.1.83 6.29±2.32

表2 两个基因位点基因频率的比较〔n(%)〕

表3 两个基因位点等位基因频率的比较〔n(%)〕

2.4 Hardy-Weinberg平衡检验 本实验人群的基因型分布与H-W平衡的理论相符合，样本具有群体代表性。

3 讨论

visfatin是一种在内脏脂肪组织中的高度表达的细胞因子，具有烟酰胺磷酸酶糖转移酶的活性(NAMPT)，因其作为从骨髓基质细胞中激活的淋巴细胞分泌的蛋白而被人们所认识，其染色体位于7q22.1和7q31.33之间，长37.4 kb，由10个内含子和11个外显子构成〔6〕。visfatin结构呈结晶状，可受激素类、噻唑烷二酮类药物的调节。visfatin对机体的急性效应包括保护缺血再灌注损伤的心肌，发挥类胰岛素降低血糖水平的作用;慢性效应为促内皮细胞激活，介导炎症反应，抗凋亡等作用。Chang等〔7〕研究证实visfatin通过NF-KB和PI3K途径有促进血管新生的作用。还有证据表明〔8〕，经冠状动脉造影证实的急慢性冠状动脉疾病中，visfatin水平较健康对照组明显升高，是独立于其他冠心病的危险因素。Garten等〔9〕发现，visfatin水平与低密度脂蛋白呈正相关，与甘油三酯呈负相关，在肥胖的代谢综合征患者中，与空腹血糖和甘油三酯呈正相关，与低密度脂蛋白呈负相关〔10〕。Berndt等〔11〕报道visfatin基因启动子的-4689G/T基因多型性对血脂、肥胖和胰岛素抵抗水平有影响。在纯合子TT基因型中血清visfatin浓度高低与肥胖程度，体重指数，空腹胰岛素相关，而在GG基因型中，只与空腹胰岛素相关。

以上研究均为visfatin在各系统中发挥的作用。目前国内外文献关于visfatin浓度与CHD相关性的研究颇多，但对visfatin的基因多态性研究甚少，尤其是与CAC的相关性研究更是少见。现在CAC被用于CHD风险的评估已被越来越多的专家所认可，认为CAC的进展可加重粥样斑块的形成，还与CHD患者的不良愈后有着必然联系〔12〕。CAC不仅与CHD诊断密切相关，而且CAC严重程度与冠状动脉狭窄程度有较高的相关性。本实验说明血清visfatin浓度在MSCG患者中是发挥一定作用的，visfatin浓度越高，冠状动脉越发生严重钙化，visfatin水平高低与CAC程度呈正相关。位点rs2058539SNP虽存在遗传突变，但是与CAC发展可能没有相互关联性。

冠心病的发病机制复杂，近年来的分子生物学研究CHD的发病机制与基因多态性相关，例如Apo-I，ACEI基因多态性等〔13〕，相关实验均证实都与CHD的发病机制相关。本研究揭示了中国山东汉族人群中冠状动脉钙化的发病与血清visfatin及其基因位点rs61330058及rs2058539多态性相关情况。CAC患者血清visfatin浓度升高，能在一定程度上反应血管内皮功能破坏情况和CAC的严重程度，提示血清visfatin水平与CAC发展密切相关。而基因研究提示visfatin rs61330058 SNP的T等位基因突变多态性与CAC的相关性，证实T基因具有保护心血管的作用，即存在基因突变后T基因的人群，其患CAC的概率就降低。目前诊断冠心病的“金标准”仍然是冠状动脉造影，此诊断方法造价高，患者住院时间长，并且为有创性检查，病人一般难以接受。本实验的临床意义即通过血清visfatin浓度和基因型的检测可以筛查CHD的高危人群，为冠心病患者动脉硬化程度的预测及开发新的药物提供理论基础，有助于早期发现和防治CHD。本实验还有一些不足之处，只做了2个基因位点的研究，其中位点rs2058539并没有做出与CAC发生发展的相关性，考虑是否与样本量小有关系。如果要揭示多个基因位点与冠心病之间的关系，还需要扩大样本量，进行综合性的研究。

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