顾 燕，孙文婷，邓胜利，张 琳，田 伟

(遵义医学院麻醉学系，贵州遵义 563099)

线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降被认为是细胞凋亡的特异性标志，同时也是早期细胞凋亡不可逆的事件。以往研究证实，通过开放线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)可以抑制线粒体膜电位的下降［1］。UrocortinⅠ(UcnⅠ)是一种由40个氨基酸残基构成的新型神经肽。近期研究发现，UcnⅠ具有一定的心肌保护效应［2］，但这一保护效应与MMP及MPP的变化与UcnⅠ和mitoKATP之间存在怎么样的关系尚未见报道。因此，本实验拟通过激光共聚焦显微镜观察UcnⅠ预处理对缺氧/复氧后大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响，来进一步阐明UcnⅠ抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 250 g左右SPF级健康雄性Sprague Dawley大鼠30只，由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供，许可证号:SCXK(渝)2012－0005。

1.2 主要试剂及仪器 UrocortinⅠ、5－羟葵酸、M199、Ⅱ型胶原酶、层黏连蛋白、EGTA、BSA均购自(美国，Sigma公司);JC－1线粒体膜电位检测试剂盒(中国，江苏碧云天生物研究所)，其他试剂为国产分析纯。SP2型激光共聚焦显微镜(德国，莱卡公司)，全自动数码成像与分析系统(美国，GenGenius，Syngene)，MPA 离体心脏灌注装置系列(中国，北京吉安得尔科技有限公司)，二氧化碳培养箱(美国，Forma公司)，倒置相差显微镜为OLYMPUS CK2公司、纯水处理器(美国，Millipore)。

1.3 实验分组与处理 成年大鼠心肌细胞的分离与培养参照文献［3］，将培养24 h后的心肌细胞随机分成4组:正常组(Nor组):37℃95%O2+5%CO2培养箱中持续培养155 min;缺氧/复氧组(I/R组):37℃95%O2+5%CO2正常培养55 min后，在37℃95%N2+5%CO2培养箱中缺氧40 min，再复氧60 min;UrocortinⅠ组(UcnⅠ组):正常培养25 min后用终浓度10－8mol/L的UcnⅠ处理30 min，缺氧40 min，再复氧60 min;5－羟奎酸+UrocortinⅠ组(5－HD+UconⅠ组):正常培养20 min后先用终浓度100 umol/L的5－HD处理5 min后，余处理同UcnⅠ组。……