张修稳，刘银华，卢林明，赵国海

(1．肥东县人民医院 普外科，安徽 合肥 231600;2．皖南医学院附属弋矶山医院 病理科，安徽 芜湖 241001;3．皖南医学院附属弋矶山医院 胃肠外科，安徽 芜湖 241001)

胃癌是源自胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，占胃恶性肿瘤的95%。在我国，胃癌平均病死率高达20/10万，占恶性肿瘤第一位。胃癌的发生、发展涉及多个基因的改变，当前对胃癌发生机制的研究已逐渐从单一基因发展到多基因协同作用和互相调节的研究。研究表明，在胃癌病例中凡有3个以上基因发生变异，大多为分化低、有淋巴结转移或恶性程度较高［1］。本文通过对胃癌组织中抑癌基因p16和KLF6的表达与临床病理特征的关系及两基因相关性的研究，探讨它们在胃癌的发生、发展、浸润和转移中的作用。

1 资料与方法

1．1 一般资料 收集皖南医学院附属弋矶山医院胃肠外科2009年1月～2010年9月手术切除并经病理证实的73例胃癌组织和相应癌旁5 cm组织;癌旁组织作对照研究。其中男性48例，女性25例，年龄42～79岁，平均(61．32 ±8．296)岁(中位数年龄55岁)。入选条件:①病史资料齐全;②术前未经放疗及化疗患者;③病理诊断均为胃腺癌，按《WHO肿瘤国际组织学新分类》标准进行胃腺癌分级:高分化、中等分化、低分化。观察并计数其淋巴结的癌转移率。

1．2 试剂 鼠抗人p16、KLF6多克隆抗体、DAB显色试剂、PBS缓冲液及S-P检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1．3 免疫组织化学SP法 将普通石蜡切片一式两份，同一批次进行免疫组化染色，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBS液洗5 min×3次，3%H2O2室温孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，高压锅抗原修复(修复液为0．01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6．0)，PBS液洗5 min×3次，两张切片分别滴加p16和KLF6一抗工作液，4℃冰箱过夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育15 min，PBS洗5 min×3次，滴加卵白素过氧化物酶复合物，37℃孵育10 min，PBS洗5 min×3次，DAB显色剂显色7 min。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。

1．4 结果判定 p16和KLF6阳性细胞染色定位于细胞质，以胞质中有浅黄、棕黄或棕褐色颗粒者为染色阳性，按染色强度判为浅黄(0分)、棕黄(1分)及棕褐色(2分)3级;按照阳性细胞比例分为＜10%(0分)、10% ～30%(1分)、3l% ～60%(2分)及 ＞60%(3分)4级。总体评分值=阳性细胞比例评分×染色强度。评分:≤2分者判为阴性;3～6分者为弱阳性;＞6分者为强阳性。

1．5 统计学处理 应用SPSS 13．0统计软件包进行处理，采用χ2检验和Spearman等级相关分析。

2 结果

2．1 p16、KLF6在癌旁组织中的表达 p16、KLF6的表达率分别为83．6%、90．41%，均高于胃癌组织中的表达率32．9%和 39．7%，χ2值分别为 38．549、41．254，差异有统计学意义(P ＜0．05)，见表 1、图 1～4。

表1 p16与KLF6在胃癌及癌旁组织中的表达Tab 1 p16 and KLF6 expressed in gastric cancer and adjacent tissues

2．2 胃癌中p16、KLF6蛋白的表达与临床病理参数关系 按照胃癌组织各病理特征进行分类，统计表明:胃癌组织中p16与KLF6蛋白的表达均与胃癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润程度有关，结果有统计学意义;与年龄、性别、肿瘤大小无关，结果无统计学意义(表2)。

2．3 胃癌组织中p16、KLF6蛋白表达的相关性胃癌组织中p16与KLF6阳性表达呈正相关(rs=0．326，P ＜0．01，表3)。

图1 胃癌组织p16蛋白阴性表达，SP×400Fig 1 p16 protein expression in gastric carcinoma，SP ×400图2 癌旁组织p16蛋白阳性表达，SP×400Fig 2 p16 protein expression in gastric adjacent tissue，SP×400图3 胃癌组织KLF6蛋白弱阳性表达，SP×400Fig 3 KLF6 protein expression in gastric carcinoma，SP ×400图4 癌旁组织KLF6蛋白阳性表达，SP×400Fig 4 KLF6 protein expression in gastric adjacent tissue，SP×400

3 讨论

P16蛋白是一种周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CDK-inhibitors)，最早由 Kamb 和 Nobori等［2－3］于 1994 年报道，它通过与细胞周期蛋白(cyclin)竞争性结合周期蛋白依赖性激酶(CDK)，从而抑制 cyclinD1-CDK4或 cyclinD1-CDK6的活性，使视网膜母细胞瘤(Rb)基因的磷酸化受阻，使其不能释放E2F，细胞周期被阻滞在G1期，从而抑制了细胞的增殖［4］。细胞周期是个复杂的过程，其中G1→S期是细胞周期调控限制点之一，其调控功能受细胞周期蛋白D(cyclin D)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDKs)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK Inhibitors，CDKI)的精密调节［5］。因此，如果 p16 基因发生了突变、缺失，则必然导致细胞的无限增殖，引起肿瘤的发生。KLF6(kruppel-like factor 6)是新近发现的抑癌基因，定位于人类染色体10P15区域，表达产物是含283个氨基酸的蛋白，其转录调节功能主要取决于非DNA结合域内的特定激活域或抑制域。其作用机制是以p53非依赖方式上调p21，进而导致细胞增殖抑制［6］。与p16作用机理类似，KLF6系通过p21使Rb基因的磷酸化受阻，进而下调细胞周期蛋白cyclin D1，干扰细胞从G1期向S期转化，抑制肿瘤细胞的生长［7］。在哺乳动物细胞周期中，CDKI与CDKs之间竞争性和cyclin D结合，共同调节G1→S期的限制点，使细胞生长、分裂与细胞生长抑制保持平衡状态。当CDKI缺失或功能异常时，CDKs与cyclin D1结合占优势，细胞周期由G1进入S期，细胞增殖失控而导致肿瘤发生［8－9］。研究表明，KLF6在多种肿瘤癌组织中呈低表达，与癌旁正常组织相比较具有统计学意义，其表达异常与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关［10－13］。KLF6基因的失活与肿瘤的生长、播散及早期的淋巴结转移关系紧密［14］。

表2 胃癌中p16、KLF6蛋白的表达与临床病理参数关系Tab 2 The relationship of p16 and KLF6 expression and clinical pathological features

表3 胃癌组织中p16、KLF6蛋白表达的相关性Tab 3 Correlation of p16 and KLF6 in gastric cancer tissues

通过对其作用机制的研究发现，p16与KLF6基因同为阻止Rb基因的磷酸化而调节转录因子E2F的活性进入细胞周期，影响细胞增殖过程的。由于抑癌基因失表达，致使细胞周期的调控发生异常，细胞增殖失控而形成肿瘤［15］。本组实验证实，p16与KLF6蛋白在胃癌组织中的表达基本一致，均显著低于癌旁正常组织，其失表达率分别为32．9%和39．7%，而两者联合检测则它们的联合阴性表达率达到了52．05%，这对提示胃癌的诊断有了明显的提高，突显出联合检测的价值。进一步分组统计发现，在低分化胃癌组织中弱阳性及阴性表达明显多于高-中分化胃癌组织，经统计学处理两组存在显著差异，说明p16与KLF6表达与胃癌恶性程度有关，恶性程度高，则蛋白表达低;恶性程度低，则蛋白表达相对较高。肿瘤浸袭性表现为浸润性生长和淋巴结转移，实验中，有浸润的胃癌相对于尚未穿透浆膜层的胃癌，表现出更少的蛋白阳性表达，经统计学处理，表明两组间存在显著差异。这使得p16与KLF6有可能成为预测胃癌恶性程度及分级的一个有用指标。有研究表明，P16蛋白表达异常是胃癌发生的早期事件，且随着胃癌的发展而逐步增加［16］。在本实验中，p16与KLF6蛋白在胃癌中的表达基本趋于一致，经Spearman秩相关检验两基因之间呈正相关(rs=0．326，P ＜0．01)。二者在淋巴结转移者的阳性表达率均低于无淋巴结转移者，随着浸润深度的增加和TNM分期的提高呈表达下降趋势，说明p16与KLF6在胃癌淋巴转移和浸润机制上存在着一定的抑制效应，两者可能存在协同作用，并且有可能成为胃癌治疗的新靶点，为胃癌靶向治疗提供分子生物学依据。

［1］ 汤钊猷．现代肿瘤学［M］．2版．上海:复旦大学出版社，2000:699．

［2］ KAMB A，GNUISN，JANE WF，et al．A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types［J］．Science，1994，264(5157)．436 －440．

［3］ NOBORI T，MIURA K，WU DJ，et al．Deletions of the cyclin dependent kinase4-inhibitor gene in multiple human cancers［J］．Nature，1994，368(6473):753 －756．

［4］ MERLO A，HERMAN J G，MAO L，et al．5'CpG is1and methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor pl6/CDKN2/MTS1 in human cancers［J］．Nat Med，1995，1:686－692．

［5］ ALEXANDER KAMB．Cell-cycle regulator and cancer［J］．Elsevier Science，1995，11(4):136 －140．

［6］ NARLA G，KREMER-TAL S，MATSUMOTO N，et al．In vivo regulation of p21 by the Kruppel-like factor 6 tumor-suppressor gene in mouse liver and human hepatocellular carcinoma［J］．Oncogene，2007，26(30):4428 －4434．

［7］ SIRACH E，BUREAU C，PERONJM，et al．klf6 transcription factor protects hepatocellular carcinoma-derived cells from apoptosis［J］．Cell Death Differ，2007，14(6):1202 －1210．

［8］ KAMB A，CRUISNA，WEAVERFELDHAUSJ，et al．A Cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types［J］．Science，1994，264:436 －440．

［9］ CALDERON MR，VERWAY M，AN BS，et al．Ligand-dependent corepressor(LCoR)recruitment by Kruppel-like factor 6(KLF6)regulates expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor CDKN1A gene［J］．J Biol Chem，2012，287(12):8662 － 8674．

［10］ DIFEO A，MARTIGNETTI JA，NARLA G．The role of klf6 and its splice variants in cancer therapy［J］．Drug Resist Updat，2009，12(1－2):1－7．

［11］ MIELE L，BEALE G，PATMAN G，et al．The Kruppel-like factor 6 genotype is associated with fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease［J］．Gastroenterology，2008，135(1):282 － 291．e1．

［12］ BUREAU C，PERON JM，BOUISSION M，et al．Expression of the transcription factor Klf6 in cirrhosis，macronodules，and hepatocellular carcinoma［J］．J Gastroenterol Hepatol，2008，23(1):78 －86．

［13］ SANGODKAR J，DIFEO A，FELD L，et al．Targeted reduction of klf6-SV1 restores chemotherapy sensitivity in resistant lung adenocarcinoma［J］．Lung Cancer，2009，66(3):292 －297．

［14］ SANGODKAR J，SHI J，DIFEO A，et al．Functional role of the KLF6 tumour suppressor gene in gastric cancer［J］．Eur J Cancer，2009，45(4):666 －676．

［15］ RUGGE M，CASSARO M，DI MARIO F，et al．Interdisciplinary Group on gastric Epithelial Dysplasia(IGGED)The long term outcome of gastric epithelial neoplasia［J］．Gut，2003，52:1111 －1116．

［16］赵国海，丁乐，史良会，等，胃癌及癌前病变中P16蛋白表达的研究［J］．皖南医学院学报，2006，25(2):94 －96．