刘 敏，黄 锐，熊克仁

(皖南医学院 解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的具有多种酶效应的毒性蛋白质，以神经毒素为主。一旦咬伤，即可引起一系列的自主神经功能紊乱的症状和体征［1］。下丘脑弓状核(arcuate nucleus，ARC)为控制自主神经活动的中枢核团之一，参与对各种自主神经功能活动的调节。c-fos和c-jun基因均是即刻早期基因(immediate early response genes，IEGs)，在受到伤害性刺激时，产物Fos蛋白和Jun蛋白以Fos-Jun的形式快速表达，因此可作为神经元受到刺激后其活动增强的标志物［2－3］。本实验从形态学角度观察眼镜蛇毒对大鼠弓状核c-fos和c-jun表达的影响，探讨眼镜蛇毒中毒的可能机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物 SD大鼠27只，雌雄不拘，体质量(250±20)g，由皖南医学院实验动物中心提供。

1．2 主要试剂 眼镜蛇毒购自安徽黄山屯溪县毒蛇养殖研究所。兔抗大鼠c-fos抗体和c-jun抗体、SABC免疫组化试剂盒和DAB显色液均购自武汉博奥森生物工程有限公司。

1．3 实验分组及方法 将SD大鼠随机分成3组，眼镜蛇毒组、生理盐水组和正常对照组，每组9只。眼镜蛇毒组:大鼠右侧大腿常规消毒后，将生理盐水与干粉状眼镜蛇毒按3∶1稀释，按0．5μl/㎏量于右侧大腿下部肌肉注射;生理盐水组:在相同部位注入等量生理盐水;正常对照组不作任何处理。均观察60 min，发现眼镜蛇毒组大鼠右侧腿部红肿，烦躁不安，嘴唇和四肢紫绀，呼吸困难等明显中毒症状时处死，同时处死生理盐水组和正常对照组大鼠。取下丘脑节段，石蜡包埋，切片，片厚5μm，切片常规脱蜡，再按下列步骤依次进行:滴加0．3%H2O2室温(18℃ ～25℃)12 min，PBS洗5 min×3次;微波修复，待自然冷却后PBS洗5 min×3次;封闭液孵育(37℃)1 h;滴加一抗 c-fos(1∶150)、c-jun(1∶1 200)，4℃冰箱过夜;37℃复温，PBS洗5 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG(37℃)2 h，PBS洗5 min×3次;滴加 SABC(37℃)1 h，PBS洗5 min×3次;DAB显色30 min，流水冲洗阻断反应，二甲苯透明、中性树胶封片，光镜观察，使用黑马图片分析软件系统拍摄及分析图片。

1．4统 计分析所得数据以¯x±s表示，用SPSS 13．0统计软件进行统计分析，采用F检验，组间两两比较采用q检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 光镜下c-fos、c-jun阳性神经元胞浆呈棕褐色，着色较深(图1、2)。眼镜蛇毒组、生理盐水组和正常对照组ARC区均可见c-fos、c-jun阳性神经元，生理盐水组ARC区c-fos、c-jun阳性神经元数量及平均灰度值较正常对照组无明显改变(P＞0．05);眼镜蛇毒组较正常对照组c-fos、c-jun阳性神经元数量明显增多(P＜0．01)，平均灰度值明显降低(P＜0．01，表1)。

2．2 眼镜蛇毒组、生理盐水组和正常对照组ARC区c-fos、c-jun阳性神经元均以梭形、椭圆形、圆形为主(图1、2);生理盐水组细胞形态较正常对照组无明显改变(P＞0．05);眼镜蛇毒组梭形、椭圆形、圆形细胞明显增多(P＜0．01，表2)。

表1 各组大鼠下丘脑弓状核中的c-fos和c-jun阳性细胞数及平均灰度值(¯x±s，n=9)Tab 1 The number of c-fos and c-jun positive cells and their average gray value in arcuate nucleus for each group of rats(¯x±s，n=9)

表2 各组大鼠下丘脑弓状核中不同形态的c-fos、c-jun阳性神经元(¯x±s，n=9，单位:个/mm2)Tab 2 Morphological difference of c-fos and c-jun positive cells in arcuate nucleus for each group of rats(¯x±s，n=9，count/mm2)

图1 c-fos蛋白在各组大鼠弓状核中的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig 1 Expression of c-fos in the rat ARC(Immunohistochemistry staining，×400)A:control group;B:saline group;C:N．atra venom group

图2 c-jun蛋白在各组大鼠弓状核中的表达(免疫组织化学染色法，×400)A:正常对照组;B:生理盐水组;C:眼镜蛇毒组Fig 2 Expression of c-jun in rat ARCof rats(Immunohistochemistry staining，×400)A:control group;B:saline group;C:N．atra venom group

3 讨论

c-fos是IEG中的一种，在正常情况下，c-fos在中枢神经系统的某些部位如ARC，有着低水平的表达，当机体受到伤害性刺激时可在几分钟内做出反应，在外界刺激-转录耦联的信息传递过程中起着第三信使的重要作用［4］。c-jun与 c-fos同属 IEG，cjun与c-fos的表达是偶联的，c-jun蛋白须与c-fos蛋白结合，从而达到共同介导目的基因的表达［5］。我室曾报道，眼镜蛇毒对丘脑网状核c-fos、c-jun的表达有上调作用［6－7］。本研究通过免疫组织化学染色发现，各组ARC区c-fos、c-jun表达定位均在神经元胞浆中，在400倍光镜视野下观察，眼镜蛇毒组较生理盐水组和正常对照组c-fos、c-jun阳性细胞数明显增多，染色较深。说明眼镜蛇毒对ARC区c-fos、c-jun表达有上调作用。c-fos、c-jun都是促凋亡基因，动物实验进行c-fos基因表达与凋亡神经元在时程、分布和数量上的相关性分析，发现c-fos基因在神经元内的高表达与神经元的凋亡密切相关［8］。资料报道，c-fos、c-jun的高表达参与细胞凋亡［9］。本研究发现眼镜蛇毒组ARC区c-fos、c-jun基因表达增加可能参与了蛇毒引起的细胞凋亡。其机制可能是:c-fos和c-jun的产物Fos蛋白和Jun蛋白经亮氨酸拉链形成联合为Fos-Jun二聚体，即转录因子AP-1特异性与DNA上AP-1结合位点结合，启动后期效应基因的转录，从而促进细胞凋亡［10－11］。本实验还观察到大鼠ARC区c-fos、c-jun阳性神经元以圆形、梭形和椭圆形为主，眼镜蛇毒组与生理盐水组和正常对照组进行比较发现，眼镜蛇毒组大鼠ARC区三种形态的细胞数量均明显增多，说明眼镜蛇毒对大鼠弓状核内三种形态的c-fos、c-jun阳性神经元影响并没有明显的选择性。

眼镜蛇毒对神经肌肉的传导有阻断作用，主要作用于突触后膜，阻断N2胆碱受体［12］，使乙酰胆碱不能传递，从而引起呼吸肌麻痹以致缺氧;还对自主神经系统有抑制作用，可抑制颈动脉窦化学感受器，使缺氧加重导致呼吸衰竭［13］。下丘脑是自主(植物)神经的皮质下中枢，弓状核位于下丘脑内侧基底部，是下丘脑中的一个较大的核团。弓状核与下丘脑内许多核团有纤维联系，也与脑干内一些植物神经元有联系，参与对内脏、心血管功能活动的调节。Banks等通过刺激大鼠颈动脉化学感受器，发现ARC参与呼吸活动的调节［14］。本实验观察到在注射眼镜蛇毒后大鼠出现了缺氧、呼吸困难等中毒症状，推测眼镜蛇毒组ARC区c-fos、c-jun表达上调可能与呼吸活动的调节有关。

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