侯小涛， 马丽娜， 邓家刚*， 王礼蓉， 郝二伟， 赵超超， 刘 鹏

(1.广西医科大学药学院，广西南宁530021;2.广西中药药效研究重点实验室，广西南宁530001;3.广西中医药大学药学院，广西南宁530001)

甘蔗Saccharum officinarum为禾本科多年生甘蔗属植物，我国主要分布在广西、广东、台湾、福建及云南等省区［1］，其中广西甘蔗产量占全国一半以上［2］，东南亚太平洋诸岛国、大洋洲岛屿和古巴等地也广为种植。甘蔗具有很高的综合利用价值，除了作为重要制糖原料外，茎秆、秆梢与叶片还可供药用、制酒精、养酵母等多种用途［1］。药理研究表明，甘蔗叶对小鼠血糖有抑制作用［3-4］;醇提取物有较好的抑菌活性［5］，乙酸乙酯部位是体外抗肿瘤的主要活性部位［6］。甘蔗叶含有丰富的黄酮类成分，LC-MS在线测定甘蔗叶中含11种黄酮类化合物［7-8］。本实验研究了从甘蔗叶中提取总黄酮的工艺，以优选最佳提取方法，并采用3种炎症模型对甘蔗叶总黄酮进行抗炎作用的研究。

1 材料

1.1 动物 清洁级ICR小鼠，体质量18～22 g，均由广西医科大学动物实验中心提供，生产许可证号:SCXK(桂)2009—2002。

1.2 药物与试剂 甘蔗叶均采集于广西甘蔗研究所28号、32号高产示范田，经广西甘蔗研究所许树宁高级农艺师鉴定为禾本科甘蔗属植物甘蔗Saccharum officinarum的叶。

芦丁 (中国药品生物制品检验所)，甲醇，乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。生理盐水 (贵州天地药业有限责任公司)，阿司匹林 (江苏平光制药有限责任公司，批号10071745)，伊文斯蓝 (上海源叶生物科技有限公司)，醋酸 (上海试一化学试剂有限公司)，二甲苯 (天津富宇精细化工有限公司)。

1.3 仪器 岛津UV160紫外-可见分光光度计;BP211DSartorius电子天平 (北京赛多利斯天平有限公司);B3500S—MT超声波清洗器 (必能信超声上海有限公司)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮提取工艺研究

2.1.1 标准溶液的制备 精密称取在105℃干燥下的芦丁对照品10.40 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，即得对照品溶液。

2.1.2 最大吸收波长的选择 采用AlCl3比色法，分别移取4.0 mL芦丁对照品和适量甘蔗叶总黄酮提取液于25 mL量瓶中，加入1%AlCl3溶液3.0 m L，定容至刻度，摇匀，静置20 min［9］，在200～600 nm之间进行扫描。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁标准品溶液(0.208 mg/mL)0.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL，置于25 mL量瓶，加入3.0 mL 1%的AlCl3溶液，混匀后加甲醇定容至刻度线，放置20 min。以第一个为空白，于417 nm测吸光度 (A)。以芦丁的质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，结果表明，芦丁的质量浓度在0.024 96～0.041 6 mg/mL线性关系良好，回归方程为:A=2.411 1C－0.324 8，r=0.999 7。

2.1.4 甘蔗叶总黄酮提取工艺流程 甘蔗叶样品烘箱干燥→粉碎过40目→加入乙醇→回流提取→抽滤→减压浓缩→定容→黄酮提取液。

2.1.5 样品总黄酮量及提取率的测定 精密吸取甘蔗叶待测液2 mL，按照1.2.2项下方法操作，测定吸光度，按照回归方程计算提取液中的总黄酮量。

2.1.6 单因素实验

2.1.6.1 提取温度的考察 取5份2 g甘蔗叶细粉，每份按照固液比1∶25加入70%乙醇分别在50、60、70、80、90℃水浴中回流提取1 h，过滤，将提取液离心5 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分别移取2.0 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.0 mL，定容至10 mL，按照标准曲线操作，分别在417 nm处测定其吸光度值为0.390、0.412、0.451、0.566、0.511。随着温度的升高，吸光度增加，即黄酮类化合物的提取率增加，在80℃时达到最大。然后随着温度的继续升高，吸光度降低，其原因可能是温度过高，引起黄酮类化合物结构被氧化破坏，导致其提取率的降低。

2.1.6.2 料液比考察 取5份2 g甘蔗叶细粉，分别按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，加入70%乙醇，在80℃水浴中回流提取1 h，过滤，将提取液离心10 min，取其清液定容至50 m L量瓶，分别移取2.0 m L提取液，各加入1%AlCl3溶液2.00 mL，定容至10 mL，按照标准曲线操作，分别在417 nm处测定其吸光度为0.333，0.412、0.542、0.558、0.570。随着溶剂量的增加，吸光度也有不同程度的增加。

2.1.6.3 乙醇体积分数考察 取5份2 g甘蔗叶细粉，按料液比1∶25，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在80℃水浴中回流提取1 h，过滤，将提取液离心10 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分别移取2.0 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.00 mL，定容至10 mL，在417 nm处按标准曲线操作测定其吸光度值，分别为0.345、0.448、0.514、0.499、0.471。开始时随着乙醇体积分数的提高，吸光度值增加，乙醇体积分数达到70%后则有所降低。当乙醇体积分数达到70%以上时，可能由于一些醇溶性杂质及色素亲脂性强的成分溶出也增多，干扰因素随之增大，从而导致黄酮类化合物的提取率下降。

2.1.6.4 提取时间的考察 取5份2 g甘蔗叶细粉，按料液比1∶25，加入70%的乙醇溶液，在80℃水浴中，分别回流提取1、2、3、4、5 h过滤，将提取液离心10 min，取其清液定容至50 mL量瓶，分别移取2.00 mL提取液，各加入1%AlCl3溶液2.0 mL，定容至10 mL，按标准曲线操作在417 nm处测定其吸光度值，分别为0.350、0.362、0.383、0.469、0.379。随着提取时间的增加，吸光度值也随之增加，提取率应该是有所提高，但是超过一定的提取时间后，有可能会破坏黄酮类化合物的结构，导致其提取率降低。

2.1.7 正交试验

2.1.7.1 正交试验设计 根据单因素试验结果，选择对本实验影响最大的3个因素，即提取温度 (70℃、80℃、90℃)、乙醇的体积分数 (70%、80%、90%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30)，提取时间 (2 h、3 h、4 h)做四因素三水平的正交试验，以甘蔗叶中总黄酮量为评价指标，对提取工艺进行优化。采用L9(34)设计正交试验，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.1.7.2 正交试验结果与分析 以单因素实验结果为基础，每个因素取三个水平数按L9(34)设计正交试验，确定最佳提取工艺。见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

根据正交实验结果表2，各因素影响甘蔗叶总黄酮提取效果的主次顺序为B＞A＞C＞D，即料液比＞提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间。由表3可知，因素A、B有显著性的差异，而因素C、D无显著性的差异，需要结合单因素考察结果，确定最佳提取工艺为提取温度80℃，料液比为1∶25，50%乙醇，提取时间为2 h。

2.1.8 工艺验证 精密称取同一批甘蔗叶细粉末2 g，平行3份，根据最佳水平组合处理:加入25倍量的50%乙醇，回流提取，在80℃下，提取2 h，过滤，分别移取2.00 mL提取液，各加入AlCl3溶液3.0 mL，定容至10 mL，摇匀，静置20 min后，在417 nm处测量吸光度值。利用回归方程计算出提取溶液中总黄酮的量，得到甘蔗叶总黄酮的平均量为6.77 mg/g，即1 g样品中含6.77 mg甘蔗叶总黄酮。

2.2 甘蔗叶总黄酮抗炎作用的研究

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀度的影响［10］取小鼠50只，雄性，体质量18～22 g，随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组 (生理盐水)、阳性对照组 (阿司匹林0.2 g/kg)、高剂量组 (4 g/kg)、中剂量组 (2 g/kg)、低剂量 (1 g/kg)组。除空白组给生理盐水外，其余各组均给予相应的药物，每天灌胃给药1次，连续5 d。末次给药45 min每只小鼠以0.02 mL二甲苯滴于右耳致炎，15 min后颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两侧耳片。用6 mm直径打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，称定质量，以左右耳片质量差值表示肿胀程度，并计算肿胀抑制率。见表4。

抑制率=［(空白组肿胀度－给药组肿胀度)/空白组肿胀度］×100%

表4 二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (±s，n=8)

表4 二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (±s，n=8)

注:与对照比较，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

组 别 剂量/(g·kg－1) 肿胀度/mg 抑制率/%P对照组 生理盐水24.25±5.28 －阿司匹林组 0.2 14.25±5.78 41.23 ＊＊甘蔗叶总黄酮低剂量组 1 17.5±5.55 27.83 *甘蔗叶总黄酮中剂量组 2 15.88±5.17 33.15 *甘蔗叶总黄酮高剂量组 4 15.12±5.51 36.41＊＊

由表4可知，甘蔗叶总黄酮1 g/kg、2 g/kg组与对照组相比，小鼠耳廓肿胀程度显著下降 (P＜0.05)，4 g/kg组与对照组相比，小鼠耳廓肿胀程度极显著下降 (P＜0.01)，说明甘蔗叶总黄酮能显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀。

2.2.2 对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响［10］取小鼠50只，雄性，体质量18～22 g，随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组 (生理盐水)、阳性对照组 (阿司匹林0.2 g/kg)、高剂量组 (4 g/kg)、中剂量组 (2 g/kg)、低剂量(1 g/kg)组。除空白组给生理盐水外，其余各组均给予相应的药物，每天灌胃给药1次，给药容量0.2 mL/10 g，连续5 d。末次给药后45 min每只小鼠尾静脉注射0.25%伊文斯蓝-生理盐水0.1 mL/10 g，同时腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。15 min后，脱颈椎处死小鼠，立即注入6 mL生理盐水冲洗腹腔，剪开腹腔，滤出腹腔洗出液，离心(2 000 r/min，10 min)，取上清液于590 nm处测定OD值，以A值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。见表5。

抑制率=［(空白组OD值－给药组OD值)/空白组OD值］×100%

由表5可知，甘蔗叶总黄酮1、2、4 g/kg组与对照组相比，伊文思蓝渗出量显著下降 (P＜0.05)，说明甘蔗叶总黄酮能显著抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性增加。

表5 小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 (±s，n=10)

表5 小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 (±s，n=10)

注:与对照组比较，*P＜0.05

组 别 剂量/(g·kg－1)OD值 抑制率/%对照组 生理盐水0.343±0.094 －阿司匹林组 0.2 0.233±0.0287 32.07甘蔗叶总黄酮低剂量组 1 0.264±0.050 23.03甘蔗叶总黄酮中剂量组 2 0.262±0.033 23.61甘蔗叶总黄酮高剂量组 4 0.257±0.027 25.07

2.2.3 对小鼠棉球肉芽肿形成的影响［10］小鼠50只，雄性，体质量18～22 g，乙醚麻醉，在各鼠的背部正中央去毛并用75%的乙醇消毒，然后用手术剪刀开0.5 cm长的小口，用眼科镊子将己精密称为10 mg的灭菌棉球从小切口植入皮下，之后用手术针缝合小鼠皮肤。然后随机分成5组，按2.2项给药剂量给药，从手术当天开始，灌胃给药每天1次，连续7 d。末次给药后5 h脱颈处死小鼠，用剪刀和镊子打开原切口，将棉球连同周围结缔增生组织一起取出，剔除脂肪组织，放入烘箱中60℃烤至恒定质量，称定质量 (mg)。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿的质量，计算肉芽肿胀抑制率。见表6。

肉芽肿胀抑制率=［(对照组平均肉芽肿质量－给药组平均肉芽肿质量)/对照组平均肉芽肿质量］×100%

表6 小鼠棉球肉芽肿形成的影响 (±s，n=10)

表6 小鼠棉球肉芽肿形成的影响 (±s，n=10)

注:与对照组比较，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

组 别 剂量/(g·kg－1)肉芽肿质量/mg 抑制率/%P对照组 生理盐水35.5±5.928 －阿司匹林组 0.2 22.75±4.928 35.91 ＊＊甘蔗叶总黄酮低剂量组 1 31.123±5.640 12.33甘蔗叶总黄酮中剂量组 2 29.75±5.884 16.2 *甘蔗叶总黄酮高剂量组 4 27.125±5.503 23.59*

实验结果显示甘蔗叶连续灌胃7 d能抑制小鼠棉球肉芽肿的形成，与空白对照组比较，差异显著。其中低剂量组有作用趋势，但无统计学意义。

3 讨论

测定总黄酮时，常选择显色系统NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色测定总黄酮的量，在此条件下，选择芦丁做对照品，在510 nm处对照品有吸收峰，但样品溶液没有吸收峰;因此，更换显色剂，选择AlC13溶液作为显色剂，200～800 nm扫描，结果对照品溶液与样品溶液在417 nm处有最大吸收峰，因此选用芦丁为对照品，显色剂为三氯化铝溶液。三氯化铝显色分光光度法测定中药中总黄酮的量，是根据黄酮类化合物分子中含有的3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基可以与铝盐定量结合，形成有色络合物的原理，通过测定有色络合物的吸光度，来测定中药中总黄酮含量的方法［9］。化学成分研究表明［7-8］，甘蔗叶中含有的黄酮苷类成分符合以上结构特征，因此，可用三氯化铝显色分光光度法测定总黄酮的量。

关于提取方法的选择，在前期中比较了回流法、超声法、浸渍法的提取效率，结果表明用回流法的提取效率最佳;通过对不同提取溶剂甲醇-水、乙醇-水的考察，结果表明用乙醇-水的提取效率最佳，故本研究在此基础上，利用正交试验法对甘蔗叶总黄酮的提取工艺进一步优化。结果显示最佳提取工艺为提取温度为80℃，料液比为1∶25，提取乙醇体积分数为50%，提取时间为2 h。

本实验研究发现，在炎症渗出和肿胀模型中，甘蔗叶总黄酮能显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀 (抑制率分别为27.83%、33.15%、36.41%)、显著拮抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高 (抑制率分别为23.03%、23.61%、25.07%)，中、高剂量均能显著抑制小鼠棉球肉芽肿 (抑制率分别为16.2%、23.59%)。实验表明，甘蔗叶总黄酮有抗炎作用，但是对于抗炎作用的物质基础及机制有待进一步研究。参考文献:

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