杨淑红 杨嗣星 姚 颐 廖文彪 赵凯亮 李永伟 宋 超武汉大学人民医院泌尿外科，湖北武汉 430060

支架材料是组织工程学研究的重要内容之一。理想的组织工程支架材料必须具有良好的生物相容性，而且适合种子细胞在支架上黏附、生长[1]。温度敏感性水凝胶（temperature sensitivity hydrogel，TSH）又被称为温固化水凝胶，当温度超过相变温度时，黏度急剧增高，由液态变为凝胶态[2]。本研究小组在前期已证实经TSH改良的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）所制备的复合支架材料与膀胱平滑肌细胞具有良好的相容性[3]。为给体内研究提供更充足的实验依据，本研究将进一步探索该支架材料与膀胱移行上皮的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

新西兰兔由武汉大学实验动物中心提供；主要试剂有：PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物（购于BASF公司），小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体 （AE1/AE3）（购于Santa Cruz公司），FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体 （购于Abcam公司），磷酸缓冲盐溶液 （phosphate buffered saline，PBS），甲醇、丙酮、戊二醛，DMEM F12培养基，Dispase酶，Ⅱ型胶原酶，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），二甲基亚砜（DMSO）、MTT均购于Sigma公司。相差倒置显微镜 （日本OLYMPUS），恒温培养箱（日本Napco公司），超净操作工作台（北京半导体设备一厂），扫描电子显微镜（日本SANYO）。

1.2 方法

1.2.1 兔膀胱移行上皮细胞的原代培养及鉴定 选用4周龄新西兰兔，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg，空气栓塞处死后，无菌条件下取膀胱前壁组织（2 cm×2 cm），小心分离膀胱黏膜与肌层，将黏膜层组织迅速置入含庆大霉素（20 μg/mL）的PBS中浸泡并漂洗3次。将黏膜组织剪碎成1 mm2大小的组织块，转入新鲜配制的Dispase酶消化液中，于4℃下消化18 h后再用PBS洗涤1次，用不锈钢网滤去组织残块，收集细胞悬液于混合消化液 （0.02%EDTA+0.25%胰酶）中。37℃振荡消化10 min，每2分钟吹打1次，直至成为单细胞悬液，加入FBS终止消化，PBS洗涤3遍，离心8 min（1000 r/min），弃上清，用培养液吹打混匀，再将细胞接种到含10%FBS的DMEM-F12培养基中，置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内常规培养。

将上述培养的细胞传2～4代后接种于盖玻片上再培养2 d，待细胞完全贴壁后，以PBS液冲洗，甲醇、丙酮固定10 min，以小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3）为一抗，以FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体为二抗，孵育、中性树胶封片，于490 nm的蓝色荧光倒置显微镜下观察。以PBS代替一抗作为空白对照。

1.2.2 ECM/TSH复合支架的构建 参考本小组前期研究[3]的方法制备TSH，使用前紫外线照射30 min备用。参照Yang等[4]报道的方法制备ECM，将成品分成32块（1 cm×1 cm），经冷冻干燥后，环氧乙烷消毒，干燥保存于4℃。在低温（4℃）真空环境下，将16块制备的ECM浸入TSH溶液中1 h，取出后经低温冷冻干燥机冻干，分装密封，经环氧乙烷消毒，常温干燥保存备用。

1.2.3 细胞相容性 实验分为四组，每组16孔，A组：ECM/TSH复合支架种植膀胱上皮细胞组；B组：单纯ECM种植膀胱上皮细胞组；C组：单纯培养膀胱上皮细胞组；D组：无细胞培养液组。种植细胞前先用培养液将支架材料预湿，取第3代膀胱上皮细胞悬液 （浓度1×105/mL）50 L缓慢接种于材料上，4 h后再加入DMEM F12培养基（含FBS），置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内培养，2 d后换液，倒置相差显微镜下观察细胞黏附、生长情况。

1.2.4 膀胱上皮细胞生长情况扫描电镜观察 膀胱上皮细胞与支架材料复合培养48 h后，A、B组各取一块材料/细胞复合物，经过PBS漂洗3次，3%戊二醛、2%的四氧化锇双重固定、脱水、醋酸异戊酯置换、干燥、喷金，扫描电镜观察。

1.2.5 细胞活力检测 膀胱上皮细胞接种后，分别于1、3、5和7 d每个时间点各取4孔，分别加入MTT（5 mg/mL），酶反应 4 h，弃上清，加入 150 μL DMSO，震荡 10 min，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长读取吸光度（OD）值（A），计算细胞相对增值率（relative growth rate，RGR）：RGR=[实验组（A组）A值-空白组（D组）A值]/[阴性对照组（C组）A值-空白组（D 组）A 值]×100%。

1.2.6 细胞计数 每5、10天从A、B两组中各取一块支架材料，用PBS清洗，去除未附着的细胞，再用0.25%胰酶消化，血球计数板进行细胞计数，观察细胞黏附数量及增殖情况。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养细胞形态

图1 空白对照组荧光显微镜观察（×200）

细胞接种时呈圆形，大小均一，轮廓清晰，胞浆透亮。接种24 h后，可见细胞贴壁生长，细胞密集生长区域可见细胞伸展后相互连接呈簇状，呈散在的簇片状分布，细胞间连接紧密，形态呈典型的“铺路石样”表现，符合上皮细胞特征。3 d后细胞进入对数生长期，7 d可连接成片，长满整个培养瓶底部。

免疫荧光检测，各代培养细胞角蛋白免疫荧光均为阳性，在蓝色荧光的照射下激发出绿色荧光，阳性率约99%。而空白对照组未激发出绿色荧光（图1），培养（12 h）的膀胱黏膜上皮细胞发出绿色荧光，细胞排列呈典型的“铺路石样”表现。

2.2 组织学检查

2.2.1 种植细胞前后的复合支架材料 倒置相差显微镜下观察：ECM为网状结构，HE染色后可见红染的胶原纤维规则排布，纤维较细，网孔较大，未见到细胞碎片；复合TSH后胶原直径变粗，网孔孔径变小。种植膀胱上皮细胞后4 h，光镜下可见细胞紧密黏附于材料表面，少数散落到培养瓶底贴壁生长。加入培养基10 h，可见细胞已伸展，有多个突起。培养3 d时，黏附于材料的细胞数量增加，细胞增殖明显。

2.2.2 扫描电镜观察 种植细胞前复合支架材料于扫描电镜下观察可见基质材料由许多连接成网状的纤维组成，纤维间呈现1～8 μm的微孔，凝胶分子覆盖其上，没有发现细胞碎片。种植后可见发育良好的细胞和细胞群黏附于材料上，伪足沿纤维伸展，附着较牢固，细胞间连接紧密，有的可见到ECM的分泌（图2），可见ECM复合TSH后，胶原直径变粗，交织成网。发育良好的细胞黏附于材料上，开始沿纤维伸展伪足，表面可见到ECM的分泌。

2.2.3 细胞活力测定膀胱上皮细胞在单纯ECM上黏附性良好，黏附率为 83.5%（24 h ODB组/ODC组），复合了TSH 后的ECM表面黏附能力较之增强，黏附率为92.3%（24 h ODA组/ODC组）。从表1中数据可以得出A、C两组的细胞数量高于B组（P=0.004），而且，A、C两组间细胞黏附数量的差异亦有统计学意义（P=0.027），三组的细胞倍增时间均为3 d。7 d时，A组细胞数量明显高于B、C组，组间差异有高度统计学意义（P=0.006），B、C 组间 P=0.041。

表1 不同时间各组OD值的比较（±s，n=4）

表1 不同时间各组OD值的比较（±s，n=4）

ABC 0.408±0.019 0.368±0.022 0.443±0.029 0.447±0.022 0.384±0.033 0.491±0.022 0.514±0.020 0.428±0.024 0.588±0.029 0.701±0.039 0.574±0.032 0.711±0.025组别 d1 d3 d5 d7

3 讨论

组织工程学是综合应用工程学和细胞生物学的原理，将体外培养扩增后的种子细胞与可降解的生物支架材料相复合，再将其回植体内缺损部位，从而再生成具有正常结构和功能的组织，达到真正意义上的生物学修复[5-6]。材料的生物相容性检测是该领域不可缺少的重要组成部分，理想的组织工程支架材料应当具有良好的细胞相容性、能够促进细胞增殖和组织形态的形成，为此本小组做了系列研究[7-8]。

与笔者前期研究结果相似，本实验中ECM/TSH复合材料比单纯ECM，纤维直径变粗，网孔孔径变小，与接种细胞的接触面积增大。经TSH修饰以后的ECM对细胞表现出更强的黏附性，为细胞的附着、生长、增殖提供了良好的微环境。超微结构观察显示，植入的膀胱上皮细胞能够紧密地附着于ECM胶原纤维之上，细胞之间形成紧密联结，周围可观察到ECM的分泌。MTT检测结果表明膀胱上皮细胞易于在ECM/TSH复合支架材料上生长，增殖情况较好，符合膀胱黏膜上皮细胞的生长规律，细胞未见凋亡和分化，实验结果提示ECM/TSH复合支架材料与膀胱黏膜上皮细胞具有良好的生物相容性，为下一步应用于体内研究提供了实验依据。

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