吴伟奋 陈春美 苏德炎 高松龄 陈庆熙 韦 浩 王春华 杨卫忠

1.福建医科大学体育教研部，福建福州 350108；2.福建医科大学附属协和医院神经外科，福建福州 350001

运动疗法在脑梗死、偏瘫康复治疗一直在运动医学界引起广泛关注。前期研究证实，脑梗死后出现的神经功能损失与一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的表达有关[1-2]。研究脑缺血偏瘫机制和治疗的经典动物模型是大鼠局灶性脑缺血模型，本研究采用线栓法闭塞大鼠右侧大脑中动脉法（middle cerebral artery occlusion，MACO）建立局灶性脑缺血大鼠模型，其目的在于探讨有氧运动促进减少神经功能缺失和脑缺血后神经细胞修复的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24 只健康成年雄性 SD 大鼠，体重（260±10）g，清洁级，来自浙江省实验动物中心，标准啮齿类饲料饲养且自由饮食，室内温度控制在20～24℃。

1.2 局灶性脑缺血大鼠模型的建立

大鼠分笼饲养，待其适应1周后，腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥钠：35 mg/kg），参照Longa等[3]学者应用线栓法闭塞大鼠右侧大脑中动脉建立脑缺血大鼠模型。将其随机分为对照组、疲劳运动组和有氧运动组，各组8只。

1.3 运动方式

有氧运动组和疲劳运动组均采用递增强度方式进行跑台运动，运动负荷参照Bedford等[4]的研究进行，有氧训练组每周5 d，共4周，起始速度为15 m/min，时间为20 min，递增速度3 m/min、时间5 min，运动至速度为20 m/min，时间为60 min后增加跑台坡度5%；疲劳训练组每周6 d，共4周，递增速度3 m/min、时间5 min，运动至速度为35 m/min，时间为（60±10）min后增加跑台坡度10%；对照组正常笼内喂养，不运动。

1.4 神经功能缺失评分

在规定的时间点时对每只大鼠进行神经功能缺失评分，评分参考 Longa等[3]的方法，评分标准是：0分，没有神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧（左）转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

1.5 脑组织标本制作

在规定的时间点对每只造模成功的大鼠进行深度麻醉，然后用生理盐水快速冲洗主动脉后，剪开大鼠头部并暴露脑组织，快速把脑组织取出，然后包埋在冰中，在大鼠右侧离额极2.5 mm处（右侧额顶叶背外侧皮质和基底节）向后切取，称重后，并按0.1 g每份分成数个等份，把其中的一份迅速置于电镜固定液，剩余的-70℃冰箱保存，留着备用。

1.6 透射电镜观察脑缺血对脑组织结构的影响

随机从各组脑组织标本中各选取一份，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾进行后固定，然后用酒精-丙酮进行脱水，用环氧树脂618包埋剂进行包埋；切成超薄切片，用醋酸铀、柠檬酸铅对其进行染色，最后应用日立Hu-12A型（飞利浦208型）透射电镜进行观察、拍照。

1.7 脑组织NO含量和NOS活性的测定

随机从各组脑组织各选取一份标本，标本上的血液用4℃预冷的生理盐水洗净，0.1 g匀浆，离心 10 min（4000 r/min），把分离得到的上清液分别用于NOS活性和NO含量的测定，按试剂盒说明书上的操作步骤进行操作。从武汉博士德试剂公司采购的NO硝酸还原酶法测定试剂盒，从南京建成生物工程公司采购的NOS活性测定试剂盒。

1.8 RT-PCR半定量分析eNOS、nNOS和iNOS基因在脑组织中的表达特点

从各组脑组织标本中各随机抽取一份，RNA用Trizol试剂抽提，并计算总RNA浓度，称重2 μg总RNA进行逆转录，再将2 μL的逆转录反应液作为模板，并在其中加入引物（β-actin，内参照）进行 PCR扩增，总反应体积 50 μL。选用的引物分别为eNOS（F5′-AGAGCATACCCGCACTTCTG-3′；R5′-GGAAGTAAGTGAGAGCCTGG-3′），nNOS （F5′-ACAAAGGAATGAATCCGTGCC-3′；R5′-GGCAGGAGGATCCAGTTAG-GA-3′），iNOS （F5′-CACGGAGAACAGCAGAGTTGG-3′；R5′-TTGTGGTGAAGGGTGTCGTG-3′），β-actin（F5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；R5′-GGATAGCACAGCCTAGATAG-3′）。 扩增条件：先用高温94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，接着按（eNOS：58℃；nNOS：55℃；iNOS：55℃）复性 30 s，72℃延伸1 min（上述各步骤循环35次），最后72℃继续延伸7 min。用1.8%琼脂糖凝胶电泳和美国伯乐BIO－RAD Gel DocTMXR凝胶成像系统对PCR产物进行观察和照相，独立重复4次实验，并用β-actin内参照作为内标，然后与同步产物进行比较，定量PCR产物，应用Quantity-one分析软件进行半定量分析，该基因mRNA的水平是通过计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值来反映的。

1.9 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺失评分

对照组、有氧运动组和疲劳运动组的神经功能缺失评分分别为（1.64±0.25）、（0.75±0.15）分和（2.85±0.33）分，三组之间差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 透视电镜观察脑组织超微结构

对照组（图1）的细胞形态及细胞核不规则；有氧运动组（图2）细胞形态和细胞核不仅规则，而且细胞表面微绒毛丰富，线粒体、内质网和溶酶体等细胞器也增多；疲劳运动组（图3）细胞核分裂，细胞质中可见线粒体肿胀明显，甚至产生空泡状变。

2.3 脑组织NO含量和NOS活性的测定结果

有氧运动组NO含量和NOS的活性均高于对照组，但低于疲劳运动组，三组之间差异均有高度统计学意义（P<0.01）。 见表1。

表1 各组脑组织NO含量和NOS活性的变化（±s）

表1 各组脑组织NO含量和NOS活性的变化（±s）

注：与对照组比较，t=15.179，*P<0.01，t＝ 7.060，△P<0.01；与有氧运动组比较，t＝ 21.503，▲P<0.01，t＝ 16.667，#P<0.01

对照组有氧运动组疲劳运动组888 0.27±0.01 0.39±0.02*0.56±0.03▲0.44±0.02 0.53±0.03△0.78±0.03#组别 例数 NO含量变化（μmol/g） NOS活性 （nmol/min）

2.4 RT-PCR半定量分析NOS基因结果

各小组脑组织标本提取的总RNA λ值（OD260/OD280）在1.80～1.97之间，凝胶电泳图显示RNA没有降解，RT-PCR产物的电泳完后，结果显示eNOS、iNOS、nNOS和内参照β-actin的特异性片段大小分别为625、342、501 bp和250 bp，三种NOS基因与内参照比值在各小组之间表达不一：有氧运动组与对照组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）；疲劳运动组与有氧运动组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01），三组之间差异均有统计学意义，说明随着运动量的增加，NOS基因的表达量也随之增加。见表2。

表2 各组脑组织NOS基因表达变化（±s）

表2 各组脑组织NOS基因表达变化（±s）

注： 与对照组比较，t=10.119， ①P<0.01，t＝24.000， ②P<0.01，t=4.707， ③P<0.01，t＝ 12.649， ④P<0.01，t=12.522， ⑤P<0.01，t＝16.282， ⑥P<0.01； 与 有 氧 运 动 组 比 较 ，t ＝ 14.000，1）P<0.01，t ＝2.000，2）P<0.01，t＝13.131，3）P<0.01

对照组有氧运动组疲劳运动组888 0.19±0.01 0.43±0.02①0.29±0.02④1）0.21±0.01 0.32±0.03②0.35±0.03⑤2）0.37±0.02 0.43±0.02③0.68±0.05⑥3）组别 例数 eNOS nNOS iNOS

3 讨论

缺血性脑损伤是目前发病率、致残率和病死率均较高的严重疾病之一，约占全部脑血管病的80%，脑缺血疾病常常出现肢体偏瘫等并发症，如何改善脑缺血疾病的并发症成为运动医学和康复医学的研究热门课题之一。同时，建立一种生理指标控制严格、操作简便、稳定可靠且重复性好、与人类脑缺血病理过程相似的理想脑缺血动物模型，对脑缺血病理机制和治疗的研究至关重要。缺血性脑血管病中由大脑中动脉闭塞（MCAO）引起者占绝大多数，所以，大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血模型的研究也是学者们研究的重点。由于Longa线栓法具有创伤小、不开颅、模型成功率高、偏瘫症状接近临床等特点，是目前应用最广泛的脑缺血动物模型方法[3]。本实验采用Longa线栓法建立的大鼠局灶性脑缺血模型后，大鼠具有以下症状：手术对侧以前肢为主的偏瘫；手术侧眼球内陷，瞳孔缩小，眼裂变小；术后大鼠运动时身体向对侧旋转，静止后尾巴呈特殊的盘绕状及体重下降等现象。这些症状的出现标志着成功建立了大鼠局灶性脑缺血模型，这是由于MCA供血区（包括颈上交感神经通路和肌力及肌紧张的皮质高级控制区）被阻塞，因此，大脑右侧中动脉阻塞就出现上述相应症状。同时，跑台运动训练是脑缺血大鼠康复治疗重要的实验研究手段，大鼠跑台运动训练方式的优点主要有以下几点：①运动方式符合大鼠日常的运动情况；②大鼠在各自的通道内进行独立运动，不会彼此干扰，使彼此之间的影响因素较少；③与游泳、运动转鼓、跳台等运动方式相比，跑台运动可以更加精确地调控大鼠运动负荷、跑台坡度和速度等。所以，本实验研究选择了跑台运动训练作为大鼠的运动方式。

NO为体内重要的信使分子和效应分子，与血管平滑肌舒张、心血管功能和神经系统的病理和生理等过程密切相关[5-6]。NO在脑缺血中的病理生理作用主要包括NO的神经保护作用和NO的神经毒性作用。NO的神经保护作用主要是通过增加脑血流、抗血小板和白细胞聚集黏附、增强突触传递、阻断N-甲基-D-天门冬氨酸 （NMDA）受体、抑制内皮素（ET）生成以及神经元对NOS的负反馈调节等机制起到对脑神经的保护作用。脑缺血时生成过量的兴奋性氨基酸（如谷氨酸），过度刺激NMDA受体，使细胞膜对Ca2+的通透性增加，胞内钙离子超载，进而引发一系列反应，最终导致神经元坏死；同时钙离子超载又激活磷脂酶、蛋白酶及NOS等多种酶，使NOS神经元产生过量的NO，大量的NO又激活NMDA受体，使钙离子通道活化，细胞外钙离子涌入细胞内，进一步加重神经元损害[7]。此外，在脑缺血条件下，过量的NO还可以通过生成自由基、损伤线粒体等途径发挥神经毒性作用。NOS是NO合成的限速酶，是调节NO的最重要环节。NOS有3种类型[8]：内皮细胞型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）、神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）。NO的双重作用在脑缺血时比较短暂，以eNOS的表达为主，由血管内皮细胞分泌eNOS而合成的NO，所产生的NO通过扩张脑血管，增加脑血流量，抑制血小板和白细胞聚集黏附，起到脑保护作用；而在脑缺血的中晚期，nNOS、iNOS起主要作用，通过介导谷氨酸毒性，生成氧自由基，影响细胞线粒体功能，增加炎症反应，诱导细胞凋亡等途径产生神经毒性，nNOS表达量不高，而由梗死灶内的吞噬细胞、炎症细胞诱导所产生的iNOS，可以通过NOS、Caspase-3和p38MAPK等基因的相互关系介导神经细胞凋亡，最终导致神经功能缺失[2，7，9]。

研究证实，运动训练能够改善脑缺血患者肢体偏瘫症状，娄淑杰等[10]建立脑缺血模型，证实跑台运动则可进一步提高海马的神经再生水平，无论是缺血侧还是健侧，跑台运动组动物海马和齿状回内免疫阳性细胞数均明显高于对照组动物。大量实验已经证实，运动训练可以促进大鼠神经功能和体重恢复，减少大鼠脑梗死体积，有利于脑缺血大鼠的康复[11-12]。这些实验结果与笔者的前期研究结果都是一致的，有氧训练增强大鼠局灶性脑缺血后神经功能修复[13]，在本组实验中，有氧运动组神经功能缺失评分低于对照组，肢体活动能力康复效果好，说明有氧运动训练能够改善脑缺血后偏瘫。NO和NOS表达与不同运动强度相关，田振军等[14]等同样采用跑台训练方式，建立了大鼠有氧运动和疲劳运动模型，不同强度运动大鼠肾脏皮质区NOS的表达均有升高，运动诱导NO的生成增加，但大强度运动可促进大鼠肾脏皮质区的细胞凋亡，且与NO大量生成有关。本实验中，与对照组比较，有氧运动组和疲劳运动组NO和NOS均有不同程度的升高，但从电镜观察细胞超微结构和神经功能缺失的评分均可以发现，有氧运动组缺血神经细胞结构修复和神经功能缺失改善明显好于疲劳运动组，其机制可能是因为有氧运动能够促进以保护神经细胞的eNOS来源为主NOS表达升高，促进NO合成增加，扩张局部血管，改善缺血神经细胞营养，促使缺血神经细胞结构和功能修复[15-16]；相反，疲劳运动能组中大强度运动量引起以神经毒性的iNOS来源为主NOS表达明显升高，促进NO合成大量合成，NO的过度表达出现局部神经细胞凋亡。

综上所述，不同运动训练强度均能够促进脑缺血区域NO和NOS的表达升高，有氧运动以促进发挥神经保护作用的eNOS表达为主，建立侧支循环，改善脑梗死局部区域血运，促进神经细胞结构修复和神经功能的恢复，而疲劳运动使iNOS表达明显升高，引起NO过表达，对局部神经细胞产生神经毒性，出现细胞凋亡现象，这对于应用适宜运动强度治疗脑缺血后偏瘫有十分重要的意义。

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