罗顺祥 徐尚华 张 虹 钟文亮 吴艳晴

1.福建医科大学附属南平市第一医院心内科一区，福建南平 353000；2.福建医科大学附属南平市第一医院骨科一区，福建南平 353000

糖尿病血管病变是严重影响糖尿病患者生命质量及致死、致残的主要原因。但临床上发现糖尿病患者冠心病的发生与血糖水平并不相关，英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）亦证明单纯血糖控制并不能达到减少糖尿病大血管合并症的目的。高血糖引起的氧化应激是糖尿病动脉粥样硬化发生的主要原因，抗氧化可延缓动脉粥样硬化的发生。血红素氧化酶-1（HO-1）是细胞保护蛋白，它分解血红素产生的一氧化碳（CO）、游离铁和胆红素，具有抗氧化、抗炎作用，可保护血管免受氧化应激及炎症介质的损伤[1]。HO-1 基因启动子区内包含着一个由GT 二核苷酸重复组成的（GT）n 短串联重复序列（STR）多态性，人 HO-1 基因启动区所特有微卫星结构的 （GT）n 长度直接影响HO-1基因的转录水平，HO-1 启动子区GT 短重复序列人体内的HO-1 表达水平更高[2]。本课题探讨2型糖尿病（T2DM）患者HO-1 基因多态性、单核细胞中HO-1 的表达水平，评价HO-1 基因多态性及HO-1 表达水平与冠心病的相关性，为进一步研究如何调节HO-1 的表达，从而应用于临床治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年6月～2011年10月，选择在福建医科大学附属南平市第一医院住院经冠状动脉造影证实合并有冠心病的糖尿病患者62例作为冠心病组，其中，急性心肌梗死2例，陈旧性心肌梗死5例，不稳定型心绞痛20例，稳定型心绞痛35例；另选择性别、年龄与冠心病组相仿，经冠脉造影证实无冠脉明显狭窄的单纯糖尿病患者59例作为对照组。其中，冠心病组62例，男35例，女27例，平均年龄（62.0±3.2）岁，合并高血压 30例、吸烟 17例；对照组 59例，男 31例，女28例，平均年龄（63.0±2.9）岁，合并高血压36例、吸烟18例。两组年龄、性别、吸烟、体重指数（BMI）、血压、空腹血糖（FPG）、餐后 2 h 时血糖（2 h PG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

1.2.1 体检和生化检查 所有患者入院后测量身高、体重、腰围、臀围和血压，计算BMI。禁食10 h 后采空腹静脉血，测定血常规、TC、LDL-C、FPG、HbA1c及 2 h PG。

1.2.2 冠状动脉造影检查 利用飞利浦公司DSA，采用经桡动脉或股动脉穿刺法进行冠状动脉造影，对每支血管进行最佳的多体位造影，以直径狭窄百分数对其进行评估。有一条主要冠状动脉直径狭窄百分数>50%诊断为冠心病，冠状动脉直径狭窄百分数<20%为正常。

表1 冠心病组和对照组基本资料比较（±s）

表1 冠心病组和对照组基本资料比较（±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa

组别例数 性别（男/女，例）年龄（岁）吸烟[n（%）]体重指数（kg/m2）收缩压（mm Hg）舒张压（mm Hg）空腹血糖（mmoL/L）餐后2 h 血糖（mmoL/L）糖化血红蛋白（%）总胆固醇（mmoL/L）低密度脂蛋白胆固醇（mmoL/L）冠心病组对照组62 59 35/27 31/28 62.0±3.2 64.0±2.9 17（27.4）18（30.5）24.6±3.7 23.7±3.5 138.5±24.5 132.8±23.1 81.6±18.4 82.3±16.5 6.7±1.3 7.1±1.0 10.4±1.8 9.8±1.6 6.7±1.6 7.0±1.4 5.20±1.04 4.95±0.73 3.56±0.49 3.29±0.57

1.2.3 HO-1 启动子区 （GT）n 检测及分型 采用荧光标记PCR 以及毛细管电泳相结合技术进行基因分型。取研究对象外周抗凝血5 mL，分离淋巴细胞和单核细胞。分离单个核细胞后，采用QIAGEN 试剂盒提取细胞基因组DNA。primer5.0软件设计扩增启动子区引物。引物序列如下：正向 ：5'-GGATTCCAGCAGGTGACATT-3'；反 向 ：5'-ACAGCTGATGCCCACTT TCT-3'。25 ML 体系PCR 扩增，PCR 扩增条件：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，循环 35次，最后 72℃延伸 10 min。PCR 产物纯化后采用ABI 公司3730 进行毛细管电泳，run 3730 data collection v2.0 收集毛细管电泳荧光信号，GeneMapper Software v3.5软件对峰图进行分型（重复次数），确定（GT）n多态性的多态。（GT）重复次数＜27，为 S 等位基因，（GT）重复次数≥27，为 L 等位基因，分别构成 SS、SL、LL 这3种基因型[3]。

1.2.4 Western blot 测HO-1 的表达 应用单去污剂裂解液提取单个核细胞蛋白质，利用BCA 法测定蛋白含量，以每孔50 μg 蛋白量加样，稳压125 V 在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再进行蛋白质的电转移（转移槽50 V 转膜1 h）。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。将膜分别与一抗、二抗反应（HO-1 一抗稀释度 1∶500，β-actin 一抗稀释度 1∶1000，二抗稀释度1∶500，室温下反应2 h）。免疫反应后将膜盖于发光试剂（北京中杉试剂公司）上反应1 min，暗室曝光3～5 min，X线片经显影、定影后待检。结果扫描进计算机，用Image-Pro-Plus 自动图像分析软件（Version：4.5）对HO-1 光带进行分析，以HO-1 蛋白带的灰度峰值代表HO-1 的表达量[4]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冠心病组与对照组（GT）n 重复序列的多态分布

在研究人群中，HO-1 基因的启动子区 （GT）n 呈高度多态性，（GT）n 重复次数为14～39次，在所有研究对象及两组内均呈双峰分布，23次和30次频率最高，（GT）n 重复次数在各组中的分布频数见图1。按文献[3]报道，将HO-1基因的启动子区 （GT）n多态性分为2个等位基因：GT 重复次数＜27次为短重复序列（S 等位基因），GT 重复次数≥27次为长重复序列（L 等位基因）。冠心病组的短重复序列（S 等位基因）明显少于对照组（P＜0.01）。所有患者因此分为携带SS、SL、LL 基因型3种。冠心病组HO-1 基因启动子区 （GT）n 重复序列基因型分布为：SS型15例，SL型16例，LL型31例；对照组分别为SS型26例，SL型16例，LL型17例，两组基因型分布存在明显差异，冠心病组短重复序列SS型明显少于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组等位基因及基因型的分布（例）

图1 （GT）n重复次数在两组的频数分布

2.2 Western blot 测HO-1 蛋白表达水平

冠心病组患者HO-1 蛋白表达明显低于对照组，分别为（10.5±1.6）、（15.6±2.2），差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）。见表3。

表3 两组血红素氧化酶-1蛋白表达水平比较

3 讨论

HO-1 是一种诱导性细胞保护酶，它分解血红素产生的CO、游离铁和胆红素，具有抗氧化、抗炎作用，可保护血管免受氧化应激及炎症介质的损伤[1]。HO-1 基因启动子内存在GT 双核苷酸重复序列，其5′端区域（GT）n 重复序列具有高度多态性，（GT）n 重复次数对HO-1 的基因转录产生不同的调节作用。依照重复次数分为S型（n＜27）和L型（n≥27），从而产生 SS、SL、LL 3种基因型。已有的研究发现HO-1 基因多态性与冠状动脉斑块负荷相关，具有L 基因型的患者较S 基因型的斑块负荷明显加重[5]。而王迎洪等[6]的研究进一步发现HO-1 基因多态性与冠心病冠脉病变程度相关，LL 基因型频率分布在多支血管病变组较单支和双支血管病变组高。但目前对于上述研究结果却存在争议，在L üblinghoff 等[7]的研究中发现HO-1 基因多态性与冠心病及心肌梗死的发生并无相关性。在本研究中发现，糖尿病患者冠心病组短重复序列（S 等位基因）明显少于对照组（P＜0.01），冠心病组基因型主要以LL型和SL型为主，对照组主要以SS型和SL型为主，两组基因型分布存在明显差异，冠心病组短重复序列SS型明显少于对照组（P＜0.05）。因此本研究认为，在糖尿病人群中，HO-1基因多态性与冠心病发病相关，相对于短重复序列（S 等位基因）者，长重复序列（L 等位基因）者为冠心病易感人群。

既往研究表明，短（GT）n 双核苷酸串联重复序列（n＜27次）使HO-1 表达含量上调，发挥抗氧化应激、抗炎症损伤、抗细胞凋亡作用，保护冠状动脉血管内皮细胞[8]。而长串联重复序列导致HO-1 转录水平下降，对血管内皮细胞的保护作用减弱[9]。李莹等[10]的研究证实在急性冠脉综合征患者HO-1 表达水平与冠状动脉病变程度相关，冠脉病变程度越重其HO-1 表达水平越低。在本研究中，冠心病组与对照组相比其血压、血脂、血糖及吸烟等均无明显差异，但冠心病组HO-1 表达水平较对照明显降低 [（10.5±1.6）和（15.6±2.2）]（P ＜ 0.01）。进一步证实，在糖尿病人群，拥有长重复序列（L 等位基因）患者，其HO-1 表达水平明显减低，更易发生冠心病。

综上所述，本研究结果提示，在糖尿病人群中，HO-1的基因多态性与冠心病易感相关，拥有长重复序列（L 等位基因）者HO-1 表达水平较拥有短重复序列 （S 等位基因）者明显减低，为冠心病易感人群。基因型分析可以预示个体冠心病易感性，但冠心病为因素交互作用所致，须做到早期综合防治。

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