张玉霞 梁琼 雍国新

近几年来学者们发现，在癌症治疗过程中导致治疗失败的主要原因是药物耐药和转移，因此对这2个表型之间的关联展开了广泛的研究［1］。自20世纪80年代初Tsurno等报道钙离子拮抗剂维拉帕米（Verapamil，异博定）能增强化疗药物对耐药细胞的毒性以来，科学家对逆转药开展了广泛深入的研究，其中对30多种不同的P-gp抑制剂做了150多个临床试验，没有一种P-gp抑制剂被美国FDA批准，这些P-gp抑制剂主要缺点是毒副作用大，溶解度差、并且改变化疗药物的药代动力学特征［2］，难以推广应用。因而筛选毒副作用小、逆转作用强的逆转药物就成为该领域的热点研究之一。

海洋生物活性物质是抗肿瘤药物研究中一个重要的研究领域。近十多年来，已从不同的海洋生物中分离到许多新型的抗肿瘤天然药物，发现其可通过抑制细胞的增殖分裂或诱导细胞凋亡的机制发挥抗肿瘤的作用。目前已有十几种抗肿瘤疗效高、毒性低的海洋生物天然药物或其结构改造化合物进入临床试验，显现出诱人的前景［3］。FAT是本实验室首次从我国南海海域生长的一种生物组织中分离出来的抗癌活性成分，具有较强的生物活性。本试验中选取典型多药耐药细胞株K562/A02作为研究对象。通过探讨FAT对K562/A02细胞的多药耐药逆转作用及其逆转机制，为其进一步研究和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 K562细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，K562/A02细胞由中国医学科学院天津血液研究所提供。

1.1.2 试剂和药物 RPMI-1640粉（美国HyClone公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；ADM（阿霉素）、VRP（美国Alexis产品）；MTT、DMSO、SDS（美国Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA）（BM公司，北京鼎国生物技术有限公司分装）；Folin-酚试剂（北京鼎国生物技术有限公司）；其它试剂（国产分析纯）。

1.1.3 主要仪器 TC2323CO2培养箱（美国Shellab公司）；CH2-TKC-3倒置光学显微镜、CH3ORF200生物显微镜（日本Olympus Optical公司）；CJT-12超净工作台（北京昌平长城空气净化公司）；DG-5031型酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）；UV-1601紫外分光光度仪（日本Shimadzu公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；420A型pH计（美国ORION公司）；ZW-A型微量振荡器（常州国华电器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 四唑盐（MTT）法药物敏感性试验

1.2.1.1 测定K562/A02细胞对ADM的耐药倍数参照周建军等［4］的改良MTT法，取细胞形态良好、对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞分别经600r/min离心；5min，吸去上清，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞数为1.1×108个/L，接种于 96孔 培养板，每孔 90μL（1×104cells），同时每孔加入不同浓度的阿霉素10μL，使其在K562细胞终浓度为：0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0μmol/L，在K562/A02细胞的终浓度为：0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 40.0μmol/L， 每 孔 终 体 积 为 100μL，每个浓度4个平行孔，其中阿霉素终浓度为0μmol/L的组为对照组，另外设调零孔（只加RPMI 1640培养液100μL，不加细胞和药物），混匀后置37℃、5％CO2培养箱中培养48h；在每孔中加入5mg/mL的MTT磷酸盐缓冲液20μL终止反应，在同样条件下继续培养4-6h；每孔加入100μL三联液过夜，使形成的甲瓒颗粒充分溶解；取出96孔培养板振荡5min，然后在DG-5031型酶联免疫测定仪上测定570nm光吸收值（A570值），分别计算各浓度阿霉素对两种细胞生长的抑制率，细胞生长抑制率=（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100％。根据Bliss方法，利用SPSS15.0软件计算半数抑制浓度IC50值［5］，再根据IC50值计算耐药倍数，耐药倍数=耐药细胞IC50值/敏感细胞IC50值。

1.2.1.2 测定FAT对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用 方法同1.2.1.1，FAT的终浓度为0、0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL。

1.2.1.3 测定FAT对K562/A02细胞耐药性逆转的影响 参照李大成等［6］的分组方法，略作修改。用FAT≤IC10（抑制率≤10％时的浓度）的剂量进行耐药逆转试验。收集对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞，调细胞浓度为1.25×108cells/L，接种于96孔培养板中，每孔80μL（含1.0×104cells）。两种细胞均分6组，试验组Ⅰ加不同浓度的FAT 10μL和RPMI-1640 培养液10μL；试验组Ⅱ同时加入不同浓度的FAT 10μL和不同浓度的阿霉素10μL，每一剂量复孔数为4。对照组Ⅰ不加细胞，只加RPMI-1640培养液100μL，用于调零；对照组Ⅱ为只加细胞不加任何药物的阴性对照，加RPMI-1640培养液20μL；对照组Ⅲ为抗癌药对照，加不同浓度的阿霉素10μL与RPMI-1640培养液10μL；对照组Ⅳ为逆转剂阳性对照，加入终浓度为10μmol/L的VRP 10μL和不同浓度的阿霉素10μL，每孔终体积均为 100μL。方法同1.2.1.1。

逆转倍数（fold reversal，FR）=逆转前 IC50值 /逆转后IC50值

1.2.2 DTNB法测定FAT对K562/A02细胞内GSH表达的影响［7］取对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞，调细胞浓度均为5.6×108cells/L，再将细胞悬液接种于24孔培养板，900μL（5×105cells）/孔，试验分组：① FAT0.02mg/mL，② FAT0.04mg/mL，③ FAT0.08mg/mL，④ VRP 10μmol/L，按试验分组分别加入相应浓度的药物工作液100μL/孔，混匀后在37℃、5％ CO2、饱和湿度的条件下培养，同时取对数生长期的K562/A02细胞和K562细胞，不加逆转剂，作为对照，48h后收集细胞到离心管中，1500r/min离心2min，弃上清液，用冷PBS洗3次，再加PBS调整细胞数为1×109cells/L，用以测定 K562细胞细胞悬液，经细胞破碎仪破碎细胞，1000 g离心和K562/A02细胞内GSH含量。取上述各组细胞数为1×109cells/L的细胞悬液，经细胞破碎仪破碎细胞，1000 g离心5min，取上清液200μL加100μL 10％磺基水杨酸混匀，1000 g离心5min，去蛋白，用上清液200μL测定OD值。方法同标准曲线的制作。

1.2.3 流式细胞仪测定K562细胞和K562/A02细胞内罗丹明123含量 取对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞，调整细胞数浓度为6.25×108cells/L，将细胞悬液接种于24孔培养板，800μL（5×105cells）/孔，两种细胞各分5组：K562细胞，K+VRP 10μmol/L（K即K562细 胞 ），K+FAT0.02mg/mL，K+FAT0.04mg/mL，K+FAT0.08mg/mL；K562/A02细胞，K/A+VRP 10μmol/L（K/A即 K562/A02细胞），K/A+FAT0.02mg/mL，K/A+FAT0.04mg/mL，K/A+FAT0.08mg/mL，每组3个平行孔，按试验分组分别加入相应浓度的药物工作液100μL，同时加入罗丹明123 100μL，终浓度为5μg/mL，终体积为1mL，混匀后置37℃，5％ CO2饱和湿度条件下培养1h，加入冷PBS 2mL终止细胞代谢，收集细胞到离心管中，1500r/min离心2min，弃上清，冷PBS洗两次，再加1mL PBS制成细胞悬液，采用美国Coulter公司生产的EPICS XL型流式细胞仪，以氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm，最大发射波长575nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细胞罗丹明123含量。

2 结果

2.1 K562/A02细胞对ADM的耐药倍数

K562/A02细胞在阿霉素10.0、20.0、40.0、80.0和160.0μmol/L各个浓度范围的抑制率见表1，K562细胞在阿霉素0.25、0.5、1.0、2.0和 4.0μmol/L各个浓度范围的抑制率见表2。根据Bliss方法计算半数抑制浓度IC50。结果显示，阿霉素对K562细胞 的 IC50为 2.6μmol/L；K562/A02细 胞 的 IC50为80.0μmol/L。K562/A02细 胞 的 耐 药 倍 数 是 30.7（表 3）。

表1 ADM对K562/A02细胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表1 ADM对K562/A02细胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

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表2 FAT与阿霉素联合作用对K562细胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

表2 FAT与阿霉素联合作用对K562细胞增殖的抑制率（％，±s，n = 4）

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2.2 FAT对K562细胞和K562/A02细胞增殖的影响

K562细胞和K562/A02细胞在FAT浓度为0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL 浓度范围的抑制率见表4。结果显示，K562细胞和K562/A02细胞在0.01-0.08mg/mL范围内对细胞生长的抑制率均≤5％，可以认为在此浓度下对细胞无直接毒性作用，因此可作为逆转剂的剂量。

表3 FAT与阿霉素联合作用对K562/A02细胞的抑制率（％，±s，n= 4）

表3 FAT与阿霉素联合作用对K562/A02细胞的抑制率（％，±s，n= 4）

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2.3 FAT对K562/A02细胞耐药性的逆转作用

在 VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04 和0.08mg/mL）浓度时，ADM对K562/A02细胞的逆转倍数分别为7.8、2.2、4.0、21.3和42.1。结果显示，FAT与逆转剂VRP一样，可逆转K562/A02细胞对ADM的耐药性，其浓度为0.04和0.08mg/mL时逆转倍数高于VRP；FAT可增强ADM对K562/A02细胞的生长抑制作用，且与剂量相关，而对K562细胞无显著影响，详见表2、表3和表5。

表4 FAT对K562细胞与K562/A02细胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

表4 FAT对K562细胞与K562/A02细胞增殖的抑制作用（±s，n = 4）

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2.4 FAT对K562/A02内GSH含量的影响

DTNB法检测结果（表6）显示，K562/A02细胞 内 GSH 含 量（231.54μmol/106cells） 远 远高 于K562细 胞 内 GSH 含 量（58.03μmol/106cells）， 为K562细胞的3.99倍；FAT可减少K562/A02细胞内 GSH 含量，VRP（10μmol/L）、FAT（0.01、0.02、0.04和0.08mg/mL）作用48h后，K562/A02细胞内GSH含量从231.54μmol/106cells分别减少到96.95、212.89、161和 122.35μmol/106cells，但仍高于 K562细胞内GSH含量，说明FAT可减少K562/A02细胞内GSH的表达，并且与剂量相关，但是效果没有VRP显著。

2.5 FAT对K562和K562/A02细胞内罗丹明123积聚浓度的影响

表5 FAT对K562细胞与K562/A02细胞耐药性的逆转作用

阿霉素、柔红霉素是治疗急性白血病的常用化疗药物，它们是通过抑制细胞内DNA的合成而发挥作用，监测白血病细胞内的阿霉素或柔红霉素浓度对临床疗效的预测有很大意义。同时阿霉素、柔红霉素化疗常导致白血病细胞的获得性耐药-多药耐药，耐药的白血病细胞常使细胞内药物的排出增加，使细胞内药物浓度降低，导致化疗失败，所以抗癌药物的浓度测定是多药耐药研究的重要课题［8］。用罗丹明123（Rhodamine 123）荧光染料作为被测抗癌药物的代表在细胞中的积累。因为罗丹明123的结构与阿霉素、柔红霉素等众多蒽环类抗癌药物的结构有许多相同之处（如有芳香杂环、有疏水性、有氮残基等），并且有强荧光性，容易测定，而且即使浓度很高也不致杀死细胞［9］。

表6 FAT处理K562/A02细胞后的GSH含量分析

图1 FAT对K562和K562/A02细胞内罗丹明123含量的影响

图2 流式细胞术分析FAT处理K562细胞后罗丹明123含量图

流式细胞术检测结果（图1）显示，罗丹明123作用1h后，K562细胞内含量（92.4％）明显高于K562/A02 细 胞（0.02％）；VRP（10μmol/L）、FAT（0.02、0.04和0.08mg/mL）作用1h后，K562/A02细胞内罗丹明123含量从0.02％分别增加到10.7％、18.3％、38.3％和50.4％，可见，FAT可增加K562/A02细胞内的罗丹明123含量，与剂量相关；但FAT 对K562细胞内罗丹明123含量没有显著影响（图2和图3）。

图3 流式细胞术分析FAT处理K562/A02细胞后罗丹明123含量图

3 讨论

多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对此种化疗药物产生耐药性，而且对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象［10］，是造成化疗失败的主要原因。由于肿瘤MDR已涉及临床常用的多种抗癌药物，因此，尽快找到可以逆转肿瘤MDR的方法，以提高临床疗效，改善患者生存质量，延长患者生存期十分紧迫［11］。

Tsurno等［12］发现钙离子拮抗剂如维拉帕米通过与抗癌药物竞争P-gp的相关结合位点增加抗癌药物在细胞内的潴留，Muller等［13］发现维拉帕米使mdrl基因转录下调逆转MDR。邓琦等［14］通过研究结果证实了通过CIK 与ADR 细胞对K562/ADR 细胞的先后作用，降低了其胞内P-gp 的表达，提高了K562/ADR 细胞内ADR 浓度，增强了ADR 对耐药细胞的杀伤活性，但是对于多药耐药的非P-gp机制却鲜有报道。

GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的小分子三肽化合物，是细胞内主要的含巯基肽，谷胱甘肽转移酶系统是存在于动植物体内的重要解毒系统。在人体内，GSH 可与多种化疗药物等氧化性物质结合，加速化疗药物的分解代谢，清除药物细胞毒性代谢产物，增强对损伤DNA的修复，从而降低化疗药物的细胞毒性作用。细胞内GSH水平增加与癌细胞对烷化剂、阿霉素及铂类化疗药物耐药性密切相关［15］，Fojo［16］也发现肿瘤 MDR 细胞内 GSH 含量明显升高。本试验也证实K562/A02细胞内GSH含量远远高于K562细胞内GSH含量。经无毒剂量的FAT作用后，K562/A02细胞内GSH含量减少，推测FAT可能通过减少GSH的表达或与GSH结合来降低细胞内GSH含量，进而增加了罗丹明123在K562/A02细胞内的积聚浓度从而逆转MDR，并且与剂量相关。徐玉乔等［17］发现环孢霉素A可以使耐药细胞GSH含量降低与自由基有关，刘明华等［18］发现川芎嗪通过影响GST降低耐药细胞内GSH含量，而FAT降低K562/A02细胞内GSH含量的机制和能否在体内试验中逆转多药耐药有待进一步研究。

本研究提示FAT与化疗药物联合应用可能会增加白血病及其他肿瘤的化疗疗效。

4 结论

本试验显示了FAT作为有效多药耐药逆转剂的一些药理学特征：无毒剂量的FAT与化疗药物ADR联合运用可以降低K562/A02细胞的IC50值，FAT还可以增加罗丹明123在K562/A02细胞内的积聚浓度，降低K562/A02细胞内GSH的含量，且呈剂量相关。推测FAT降低K562/A02细胞内GSH的含量是FAT逆转MDR的机制之一。

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