王红霞 王华明 张大龙 罗成

木聚糖是细胞中最具代表性的半纤维素，约占细胞干重的35％，可以作为再生资源被利用［1］。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成，起主要作用的是内切β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC3.2.1.8），简称木聚糖酶，是当前木聚糖酶类的研究热点。木聚糖酶作用于木聚糖和长链木聚糖，从β-1，4-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以产生少量木糖和阿拉伯糖。

木聚糖酶是涉及半纤维素水解的主要酶，因而具有重要的应用价值。研究表明，木聚糖酶在许多工业中都有广泛的用途，如食品、动物饲料、制浆造纸、环境等［2，3］。但是，木聚糖酶要实现有效应用，要求其具有良好的酶学性质，在不同领域应用要求其具有不同酶学性质［4］。自20世纪70年代末，80年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达［5-10］。

我国对木聚糖酶的研究最近十几年才开始，基本上还限于天然菌株的筛选、酶的纯化及酶学性质的分析上［11，12］。目前大多是从木霉、黑曲霉中克隆木聚糖酶基因，还没有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表达的报道［13-16］。葡萄穗霉具有嗜纤维性，且对于碱性条件也有较好的耐受性［17］。本研究将从葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205，利用黑曲霉（G1）表达系统实现胞外分泌表达，并对所产重组木聚糖酶的酶学性质进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒 木聚糖酶基因xya6205为本实验室保藏的葡萄穗霉中克隆；大肠杆菌菌株E.coli Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司；黑曲霉G1为本实验室保藏。

1.1.2 试剂 限制性内切酶SnaBⅠ、XbaⅠ、T4连接酶、Gel Extraction Kit、PCR Kit、PlasmidKit等均购自Fermentas公司；木聚糖酶底物桦木木聚糖（birch wood xylan）购 自 Sigma公 司；KOD-plus购 自TO-YOBO公司；其它生化试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基 LB、CMC、amds乙酰胺选择培养基［18］、promosoy specialmedium 产酶培养基、CSL生长培养基均按照常规实验室标准配置。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶基因xya6205在葡萄穗霉全基因组上的挖掘 通过比较基因组学，葡萄穗霉全基因组上部分基因功能注释可能为木聚糖酶，其中13个序列可能为β-内切木聚糖酶。为了克隆最有可能的内切木聚糖酶基因，采用预先建立内切木聚糖酶基因序列库，并将相应序列分别进行本地BLASTp，同时将这些序列在NCBI进行在线BLASTp。将本地及在线BLAST结果结合分析，确定最有可能的内切木聚糖酶序列进行克隆。

1.2.2 重组质粒pGm-xya6205的构建和克隆 根据挑选的xya6205基因的序列以及表达载体pGm的多克隆位点的特征，设计引物（表1）由上海Invitrogen公司合成。

表1 克隆xya6205使用的引物

PCR扩增得到的木聚糖酶基因xya6205，经琼脂糖凝胶回收纯化，用SnaB I和Xba I双酶切，连接到载体pGm多克隆位点，得到重组质粒pGmxya6205。将其向感受态大肠杆菌Trans 5α中进行转化，30℃倒置过夜培养16h，挑取适中大小的转化子进行菌落PCR验证。验证正确的用加氨苄的LB培养液培养24h后，提取质粒。

1.2.3 黑曲霉重组表达载体的构建及转化子的筛选和鉴定 黑曲霉原生质体的制备参照Wernars等的方法操作［19］。将构建的重组质粒pGm-xya6205与100μL原生质体混合，并加入12.5μL PEG缓冲液（PEG4000 50％，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），冰上静置20min后再加入1mL上述PEG缓冲液，2mL山梨醇溶液（山梨醇1.2mol/L，CaCl20.05mol/L，Tris 1mol/L，pH7.5），并与融化的AMDS上层培养基混匀，立即平均铺于3个AMDS 下层培养基平板上，30℃培养5-7d。

挑取转化子到二次验证板上，同时挑取阳性对照和阴性对照，30℃继续培养，若能继续生长则为阳性转化子，进行菌丝PCR验证。菌丝PCR验证操作过程参见Finnzymes的Phire®plant direct PCR kit操作说明书。验证正确的转化子转接到斜面上保存，同时保存孢子悬浮液，用甘油管储存于-80℃冰箱。

1.2.4 重组黑曲霉工程菌株的表达 从斜面上用无菌竹签挑取孢子，接种到25mL的产酶培养基三角瓶中，摇床培养，30℃，200r/min；3d后取发酵液，离心，10000r/min，8.5min，取上清 30μL，加入 10μL 4倍上样buffer（已煮沸），水浴煮沸5min；10000r/min离心1min，待用。

配置SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，待凝固后点样，加入缓冲液，接通电源，首先80 v电压跑胶，待蛋白样跑出凝缩胶后改电压为120 v，直至其跑到最底线；考马斯亮蓝染色 30min；脱色液脱色3次，每次30min，最后用清水浸泡过夜。

1.2.5 重组黑曲霉表达产物酶学性质分析 采用DNS法测定木聚糖酶的活性［20］。酶活定义为：在一定条件下（pH5.5，37℃），每分钟产生 1μmol木糖所需的酶量为一个酶活力单位（1U）。采用Brandford法测定发酵液中的蛋白含量。酶活力和酶学性质的测定每组试验设3个重复，取平均值计算。

最适pH的测定：配置不同pH2.7-9.0的缓冲液，在37℃条件下分别测定不同pH值下重组酶的活性。以最高酶活为100％计。

最适温度的测定：在最适pH条件下，测定不同温度（30-80℃）下重组酶的活性。以最高酶活为100％计。

酶的耐热性试验：重组酶在最适反应温度水浴条件下处理5、10、15、20、25和30min后，在最适反应条件下测定残余酶活，以未处理为100％计。

酶的pH稳定性试验：在室温（25℃）条件下，将重组酶液在不同pH缓冲液中（pH2.8-8.2）处理18h后，取2mL在酶活测定反应体系中测定其残余酶活，以未处理为100％计。

2 结果

2.1 黑曲霉重组表达载体的构建

经PCR扩增得到了大小正确（1699bp）的xya6205基因（图1）。

图1 PCR扩增产物的电泳分析

挑取5个大肠杆菌菌落进行菌落PCR验证，其中一个菌落得到了大小正确的xya6205基因（图2）。将该重组质粒pGm-xya6205寄送到博尚生物技术有限公司进行双向测序。测序结果用DNAMAN软件与正确序列进行比对，发现没有发生突变，完全正确，重组质粒pGm-xya6205构建成功。

图2 菌落PCR鉴定

2.2 黑曲霉的转化

重组质粒pGm-xya6205以同源重组的方式进入到黑曲霉GAP3染色体上，因pGm上具有来自构巢曲霉的amds基因，可以利用乙酰胺作为唯一氮源，因而试验中采用amds培养基培养转化黑曲霉，可初步方便快捷的筛选出含pGm-xya6205的重组菌株。

筛选后共得到25个阳性转化子。

2.3 重组黑曲霉菌株的PCR快速鉴定

将筛选到的25株转化子，分别进行菌丝PCR快速验证，经琼脂糖凝胶电泳分析，有18株得到了1699bp的xya6205基因条带（图3）。

图3 黑曲霉转化子菌丝PCR快速鉴定

2.4 重组蛋白的表达

挑取8株菌丝PCR快速验证呈阳性的转化子及阴性G1进行摇瓶培养，SDS-PAGE（图4）显示，有6株在25kD处出现条带，而阴性无目的条带。

2.5 重组酶酶学性质的分析

DNS法测得1L发酵液在第5天时酶活达到最高（392U/mg）。重组酶的最适pH值为5.8，如图5所示，在pH5.0-9.0范围内酶活均比较高，尤其是在碱性范围内，仍有60％以上的酶活。

图4 重组木聚糖酶表达的SDS-PAGE

图5 重组木聚糖酶的最适反应pH

重组酶最适温度为50℃（图6），在60℃仍有80％酶活，70℃时下降较快，残余酶活仅为29.9％。

图6 重组木聚糖酶的最适反应温度

酶的耐热性试验（图7）表明，重组酶在50℃下保持5min时，残余酶活还剩80％左右，超过30min酶活仅有23％。另外将重组酶分别在30、40、50、60、70和80℃下金属浴处理30min后，测定剩余酶活，以未处理的为100％计，在40℃以下酶活性几乎无损失（图8）。

图7 重组木聚糖酶在50℃的热稳定性

图8 重组木聚糖酶温度稳定性

重组酶的pH稳定性如图9所示，在pH5.2-8.2环境中处理18h后酶活较稳定，存在70％以上的残余酶活，pH6.8时最高，为83％。

图9 重组木聚糖酶的pH稳定性

3 讨论

黑曲霉表达系统是近年来逐渐广泛使用的新型外源蛋白真核基因表达系统之一。该表达系统具有以下特有优点：表达量大；胞外分泌率高；蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞；表达的外源蛋白具有天然活性；良好的安全性［21］。

丝状真菌葡萄穗霉具有嗜纤维性和嗜碱性，可以在低氮条件下生长，适宜条件下能够产生多种真菌毒素和其它活性产物。目前还没有葡萄穗霉木聚糖酶基因克隆表达的报道。本试验中，将从葡萄穗霉中克隆得到的木聚糖酶基因xya6205（不含自身启动子）插入到pGm载体的多克隆位点，利用来自于黑曲霉glaA的强启动子，使目的基因在黑曲霉G1中得到了高效分泌表达。重组木聚糖酶产量达392U/mg，表达产物具有生物活性，为进一步的工业化发酵生产提供了良好的出发菌株。

该木聚糖酶的最适温度为50℃，最适pH为5.8。在pH5.0-9.0范围内酶活均比较高，尤其是在碱性范围内，仍有60％以上的酶活，其碱性稳定性也较高，在pH8.2环境中处理18h后，仍有70％残余酶活。在造纸工业中，碱性木聚糖酶作为纸浆预漂白助剂，可以提高纸浆生产能力和纸浆亮度，降低废水中有机氯含量。重组酶优良的碱性稳定性为其工业应用的开发奠定了基础。

4 结论

本研究克隆、异源表达了具有活性的葡萄穗霉木聚糖酶基因，其粗酶液木聚糖酶比活达392U/mg，最适温度为50℃，最适pH为5.8，在不同pH缓冲液中处理18h后，最高仍有83％残余酶活，是一种新型碱性木聚糖酶。

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