荣曼 张锐虎 刘田福

甘丙肽是一种广泛分布外周和中枢神经系统的神经肽，研究发现，它具有调节胰腺分泌，促进食欲，抑制脂肪组织中抵抗素基因的表达，影响胃肠蠕动，提高垂体生长激素，催乳素，促黄体生成激素释放等功能，尤其在学习，记忆，痛觉和脊神经反射等神经功能方面发挥重要作用。国外不仅利用外源甘丙肽，甘丙肽拮抗或者激动剂深入研究甘丙肽在神经组织和外周的作用，并且已成功建立了甘丙肽过表达的转基因小鼠［1］；国内也在甘丙肽对阿尔茨海默症，抑郁症，癫痫等的影响方面取得了很大进展，但仍缺乏内源性过表达的甘丙肽用于进一步的疾病模型研究。本课题将延用本实验室已有的科研成果——重组克隆质粒pUC18-PDGF-GAL［2］，以其为模板，利用PCR技术扩增目的片段PDGF-GAL，然后将其定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1获得重组表达质粒pcDNA-PDGF-GAL，采用脂质体法将重组质粒瞬时转染神经母细胞瘤细胞实现甘丙肽基因的过表达，为下一步经G418筛选获得稳定细胞克隆从而深入研究过表达甘丙肽的相关作用机制做准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 N-2a购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.2 菌株和质粒 pcDNA3.1，由本实验室所保存，大肠杆菌DH5α，pMD19-T simple vector均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 试剂和培养基 DNA A-Tailing Kit，RT-PCR Kit，RNAiso Reagent均购自宝生物工程（大连）有限公司；Bgl II和Xho I限制性内切酶购自NEB公司；Plasmid Mini Kit 购自Omega公司；澳洲血源特级胎牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；小鼠甘丙肽ELISA试剂盒48T购自上海，属进口分装。……