荣曼 张锐虎 刘田福

甘丙肽是一种广泛分布外周和中枢神经系统的神经肽，研究发现，它具有调节胰腺分泌，促进食欲，抑制脂肪组织中抵抗素基因的表达，影响胃肠蠕动，提高垂体生长激素，催乳素，促黄体生成激素释放等功能，尤其在学习，记忆，痛觉和脊神经反射等神经功能方面发挥重要作用。国外不仅利用外源甘丙肽，甘丙肽拮抗或者激动剂深入研究甘丙肽在神经组织和外周的作用，并且已成功建立了甘丙肽过表达的转基因小鼠［1］；国内也在甘丙肽对阿尔茨海默症，抑郁症，癫痫等的影响方面取得了很大进展，但仍缺乏内源性过表达的甘丙肽用于进一步的疾病模型研究。本课题将延用本实验室已有的科研成果——重组克隆质粒pUC18-PDGF-GAL［2］，以其为模板，利用PCR技术扩增目的片段PDGF-GAL，然后将其定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1获得重组表达质粒pcDNA-PDGF-GAL，采用脂质体法将重组质粒瞬时转染神经母细胞瘤细胞实现甘丙肽基因的过表达，为下一步经G418筛选获得稳定细胞克隆从而深入研究过表达甘丙肽的相关作用机制做准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 N-2a购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.2 菌株和质粒 pcDNA3.1，由本实验室所保存，大肠杆菌DH5α，pMD19-T simple vector均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 试剂和培养基 DNA A-Tailing Kit，RT-PCR Kit，RNAiso Reagent均购自宝生物工程（大连）有限公司；Bgl II和Xho I限制性内切酶购自NEB公司；Plasmid Mini Kit 购自Omega公司；澳洲血源特级胎牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；小鼠甘丙肽ELISA试剂盒48T购自上海，属进口分装。

1.1.4 主要引物 常规PCR引物、RT-PCR均参照GenBank中GAL基因和cDNA的标准序列，使用Primer Premier5.0，Oligo6.0软件进行设计分析，PCR正向引物 F：5'-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCTGAGTA-3'，反向引物 R：5'-CCGCTCGAGCAGTCCCAGATACTTGCTAG-3'；RT-PCR正向引物F：5'-GCAGTAAGCGACCATCCAGC-3'，反向引物 R：5'-AGGACACACGTGCACAGTGG-3'；内参正向引物F：5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，反向引物R：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段PDGF-GAL的扩增 以pUC18-PDGF-GAL质粒为模板，PCR获得5'端具有Bgl II酶切位点，3'端具有Xho I酶切位点的目的片段。

1.2.2 重组质粒pMDT-PDGF-GAL的构建 胶回收目的片段，经加A反应，与T载体经T4连接酶16℃过夜连接，并以线性T载体自连为阴性对照，连接摩尔比为3∶1，经转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选，扩大培养等过程，对提取的质粒进行PCR法，酶切鉴定后经测序终获得pMDT-PDGFGAL。

1.2.3 GAL特异性表达质粒的构建 取最终测序正确的质粒pMDT-PDGF-GAL和pcDNA3.1分别用Bgl II和Xho I酶双酶切后经T4连接酶16℃过夜连接，并以线性化pcDNA3.1和pMDT-PDGF-GAL自连为阴性对照，转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄抗性筛选，扩大培养等过程，对提取的质粒进行PCR和酶切鉴定后再送交测序中心，将最终鉴定正确的重构质粒命名为pcDNA-PDGF-GAL。

1.2.4 细胞的复苏、传代及冻存 从液氮中取出冻存细胞立即放入40℃水浴，震荡使其快速溶解1min，然后移入含有9mL完全培养基的离心管中，室温下1200r/min离心吹吸混匀后移入培养瓶中继续培养。N-2a细胞用全血清DMEM培养液（10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素）在75cm2培养瓶中附壁生长培养，细胞达到80％融合时以1∶3进行传代。选第3-6代细胞以2×107进行冻存，冻存前一日更换新鲜培养基，冻存液含20％胎牛血清，5％ DMSO，冻存过程：4℃ 20min，-20℃ 30min，-80℃过夜后投入液氮长期保存。

1.2.5 细胞增殖率的测定（MTT法）细胞以1×103/孔接种于96孔板后分别在培养24、48、72、96、120和144h 后进行MTT检测。每孔加入5mg/mL MTT 20μL，在CO2细胞培养箱内继续孵育4h，终止培养，小心吸去孔内培养液（注意勿吸出孔板内结晶），然后每孔加入150μL DMSO，室温下将培养板置于微孔板振荡器振荡10min，置于酶联检测仪于570nm处检测各孔吸光度值，以空白孔调零，绘制细胞生长曲线［3］。

1.2.6 细胞转染 细胞瘤细胞生长汇合率为70％时收获细胞，转入两个6 孔板，培养至80％以上汇合时分成两组，阳性转染组（脂转pcDNA3.1-PDGFGAL质粒转入N-2a细胞）：6 孔板中随机抽取4孔，分别标记为第①、②、③和④孔，每孔加完全培养基2mL、含脂质体2000 10μL的DMEM培养基250μL、含GAL重组质粒4.0μg的DMEM培养基250μL；阴性对照组（脂转pcDNA3.1质粒转入N-2a细胞）：6 孔板中任选孔分别标记为第⑤，⑥，⑦和⑧孔，每孔加完全培养基2mL、含脂质体2000 10μL的 DMEM 培养基 250μL、含 PcDNA3.1 质粒 4.0μg的DMEM培养基250μL；空白对照组：6孔板中其余孔分别标记为*，每孔加DMEM培养基2.25mL、含Lipofectamine 2000 脂质体10μL的DMEM培养基250μL。6孔板置于37℃、5％ CO2、90％湿度条件下脂转4h后更换为完全培养基。

1.2.7 细胞转录水平的鉴定 分别在转染后24、48和72h Trizon法提取不同组细胞总RNA，用紫外可见分光光度计检测定RNA的浓度为0.48μg/μL，纯度为2.0，然后以内参GAPDH为标准进行RT-PCR，25μL的 PCR 反应体系包括 cDNA 2μL，10×PCR缓冲液 5μL，10mmol/L 各类 dNTP 3μL，2.5 U Taq DNA合成酶，GAL及GAPDH正、反向引物各2μL，RNase Free dH2O加至反应物总量50μL。轻柔吹吸混匀并短暂离心收集附壁液体后，将样本置入PCR热循环仪，开始PCR反应，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性 30s，64℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环。最后于72℃终延伸，10min。所有的标本重复测定3次。在扩增终点取5μL的产物，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。凝胶图像分析系统进行条带光密度扫描，以GAPDH校正做GAL相对表达量分析。

1.2.8 酶联免疫吸附测定（Enzyme link immunosorbent assay，ELISA）检测GAL水平 参照 ELISA试剂盒的产品说明书进行操作，分别测定不同时间段培养上清液GAL表达水平，ELISA测定时同时设空白孔、标准孔、待测样品孔，严格参照产品说明书操作后用酶标仪在 450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值），根据标准曲线计算出上清液GAL水平，结果以ng/mL或ng/mg蛋白表示。

1.2.9 统计学处理 试验中所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计处理，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pMDT-PDGF-GAL的鉴定

常规PCR，电泳鉴定PCR产物与目的片段PDGF-GAL理论大小2 896bp相符（图1）。与T载体连接后重组质粒的酶切鉴定，超螺旋质粒大小4000bp左右，单酶切线性化质粒在5 500bp左右，与理论值5 588bp相符，双酶切结果由于目的片段和T载体骨架大小相似，差100bp左右，双酶切鉴定结果不易分辨（图2）。

图1 以重组T载体为模板的PCR电泳图

图2 重组T载体经单酶切和双酶切后电泳图

2.2 重组表达质粒pcDNA-PDGF-GAL的鉴定

常规PCR，电泳鉴定PCR产物与目的片段PDGF-GAL理论大小2 896bp相符；与质粒pcDNA3.1骨架连接后重组质粒的酶切鉴定，其中环状质粒大小约为6000bp，重组质粒单酶切线性化后理论大小为7 500bp，pcDNA3.1经双酶切后的骨架大小为4 600bp，目的片段PDGF-GAL大小在3000bp左右（图3）。测序结果与理论上的重组片段进行比对，相似性达到99％。

2.3 N-2a细胞生长曲线的绘制

由图4可知接种后48h后即图示第2天细胞数明显比接种后24h时显著减少（P＜0.05），又经过一定潜伏适应期后进入对数生长期，接种后第6天后细胞渐趋于生长稳定。另外本试验也曾尝试6孔板和12孔板等以不同密度接种，无论台盼蓝染色计数或者MTT法测定均显示接种后48-60h细胞活力较差，说明N-2a细胞对培养环境的改变较敏感，鉴于N-2a细胞的生长特点，转染试验适合于在细胞以一定密度接种后3-5d生长活力相对旺盛的时候进行以获得最佳转染效果。

图3 重组表达载体经单酶切和双酶切后电泳图

图4 N-2a细胞生长曲线

2.4 脂质体法转染后不同时间段GAL转录水平的鉴定

转染后48h细胞中GAL瞬时表达量最多，并且凝胶图像分析系统进行条带光密度扫描（图5，图6），以 GAPDH 校正做GAL相对表达量统计分析后与转染后24h和72h GAL的表达量以及与对照组GAL表达量具有显著差异（P＜0.05），以空质粒转染后48h细胞中GAL表达量与对照组表达量没有统计学差异（P＞0.1）。

2.5 脂质体法转染后不同时间段GAL表达水平的鉴定

瞬转后随着时间的增长细胞上清中GAL表达量明显增加，与对照未转染组上清GAL表达量具有显著性差异（P＜0.05），见图7。

图5 48h后GAL RT-PCR结果

图6 不同时间GALRT-PCR结果

图7 ELISA法测定瞬转后不同时间上清中GAL蛋白含量

2.6 瞬时转染后过表达甘丙肽对细胞形态的影响

脂质体法转染细胞后72h后倒置显微镜下观察到有一部分明显分化趋势的细胞，个别已近似神经元形态（图8）。

3 讨论

甘丙肽是近几年来倍受研究者关注的一个基因，其功能是通过GAL受体GALR1、GALR2、GALR3中的一个或多个介导的，由此研究者从甘丙肽与其不同受体及其它物质的相互作用着手，深入研究其与各种疾病的联系。在阿尔茨海默症病人脑组织检测到过量的甘丙肽，低于正常水平的α促黑色素细胞激素，说明甘丙肽和α促黑色素细胞激素参与调节记忆过程［4］，不仅仅在神经系统，研究者在皮肤肉芽组织形成过程中检测甘丙肽和甘丙肽受体的表达，并证实一些甘丙肽是由成纤维细胞样细胞所释放［5］。总而言之，甘丙肽及其相关蛋白在机体生理或病理状态下的作用是广泛而复杂的。

图8 空质粒转染组与GAL过表达试验组细胞图像（10×）

本试验成功构建了由神经特异性启动子PDGF-β驱动GAL靶向神经组织特异性表达的真核表达载体pcDNA-PDGF-GAL，测序正确后脂质体法瞬时转染小鼠神经母细胞瘤细胞N-2a，分别于转染后不同时间从转录水平和表达水平检测GAL的过表达情况。转染试验中通过绘制细胞生长曲线获得细胞生长活力最佳时期，严格按照转染试剂说明书步骤操作及依照相关文献通过调节配制核酸脂质体复合物所用的培养基pH等［6］措施，以携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1进行转染预试验从而获得转染试验最优化参数，最终实现GAL在N-2a的过表达。

另外，细胞转染后72h倒置显微镜下观察到有一部分明显分化趋势的细胞，个别已近似神经元形态，文献中曾报道外源性甘丙肽有促进已分化的神经干细胞神经突生长的作用［7］。但是，至于本试验中所观察到的现象是否说明内源性甘丙肽过表达后会促进N-2a的分化，以及可能的促神经突生长作用有待进一步通过外源甘丙肽干预N-2a细胞等试验来证实。

4 结论

本试验成功构建了由PDGF-B启动子驱动GAL靶向神经细胞特异性表达的真核表达载体pcDNAPDGF-GAL，并采用脂质体法瞬时转染N-2a最终实现了甘丙肽的过表达，为进一步稳定转染细胞系的获得及甘丙肽生理病理等功能的研究奠定了一定的试验基础。

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