张奇龙 徐 红 王 丽 肖 竦

（贵阳医学院化学教研室,贵州贵阳550004）

光石韦为水龙骨科蕨类植物光石韦Pyrrosia calvata(Bak.)Ching的全草，别名大肺痨草。具有清热、利尿、止咳、止血的功效，主治：肺热咳嗽、痰中带血、小便不利、热淋、沙淋、颈淋巴结核、烧烫伤、外伤出血[1,2]。石韦属植物含有黄酮类化合物[3]。研究表明，黄酮类化合物具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗突变、抗溃疡、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4]。鉴于黄酮类化合物具有多种生理活性，对黄酮的研究具有重要的意义。不同种的石韦中总黄酮及其它有效成份的含量可能存在差异，这会导致不同种石韦在药用功效上的不同，通过对这些物质的测定，可对药材的品质进行评价[5]。已有文献报道对石韦、毡毛石韦、华北石韦、有柄石韦、庐山石韦中的总黄酮进行提取和含量测定[6,7]。但是，对光石韦中总黄酮含量的提取和测定未见文献报道。我们对光石韦中总黄酮的提取工艺及含量测定进行研究，为光石韦的有效利用提供参考。本实验采用正交实验设计探究光石韦总黄酮的提取工艺，以芦丁为对照品，用紫外分光光度法测定总黄酮含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器:UV-2401型分光光度计 (日本岛津)，BS210S型万分之一电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，RE-52AA旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)，DF-101S数控集热式磁力搅拌器 (杰瑞尔电器有限公司)，HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.2 材料:光石韦 (Pyrrosia calvata(Bak.)Ching)药材采自贵州省安顺市紫云县候场镇，经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为光石韦。无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚(试剂为分析纯)。

2 实验方法

2.1 总黄酮的测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备：精密称取芦丁标品 (干燥)20 mg，置于70%微热乙醇中超声溶解，定容至 200 mL，摇匀，得浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液。

2.1.2 吸收波长的选择：根据文献方法[8]精密量取芦丁对照品液5.0 ml至25 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加70%乙醇 0.4 mL，摇匀，放置 15 min，置于比色皿中，在波长400～600 nm之间测定吸光度，结果最大吸收波长在510 nm。

2.1.3 标准曲线的制备：分别精密吸取上述芦丁标准0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 6只 15 mL具 塞 试 管中，分别加 70%乙醇至 5 ml，加 5%NaNO2溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加 70%乙醇0.4 mL，摇匀，放置 15 min，于 510 nm波长处以第一支试管溶液为空白对照，测定吸光度，结果见表1。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程 A=11.238C-0.0022，r=0.99928。

表1 浓度与吸光度

2.1.4 光石韦中总黄酮的提取和含量测定：将光石韦洗净，低温烘干，用电动植物粉碎机粉碎。称取100 g于烧杯中,加入石油醚浸泡过夜脱脂去色，然后经布氏漏斗抽滤，滤渣风干，得脱脂去色的光石韦样品，精确称取脱脂去色的光石韦样品9份，每份 5.0 g，按照三因素三水平实验设计(见表2)的 9种提取方案，分别回流提取材料中的总黄酮，过滤收集滤液，将滤液减压浓缩并回收乙醇，得浸膏。将浸膏在60℃下真空干燥，研碎后得光石韦总黄酮粗提物。精密称取浸膏 10 mg，溶解，定容至 25 mL，精密量取 4 mL的供试品溶液，自“加 70%乙醇溶液至 5 mL……”同上，以 70%乙醇为空白试剂，在最大吸收波长处测定各供试液的吸光度，并计算总黄酮含量。

2.1.5 精密度实验：称取脱脂去色的光石韦样品5.0 g，利用正交实验选取的最佳方案制备供试品溶液。测定方法同上，连续测定5次。计算相对标准偏差RSD值为0.28%，表明该方法精密度良好 。

2.1.6 稳定性试验:取供试品溶液，于 10、20、30、40、50、60 min时测定吸收值。计算 60 min内吸光度的RSD值为 0.30%，表明吸光度在60 min中内稳定。

2.1.7 重复性试验:称取脱脂去色的光石韦样品 6份，每份5.0 g，按正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项进行分析，计算样品中总黄酮含量的 RSD值为 2.10%(n=6)，表明重复性良好。

2.1.8 回收率实验:精密称取已知总黄酮含量的光石韦样品 6份，每份5.0 g，加入适量标准品，按正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项进行测定，经计算得平均回收率为 99.00%，RSD值为2.20%，表明回收率良好。

2.2 提取工艺的优选

2.2.1 正交试验设计：为了系统考察乙醇提取法的条件参数，确定乙醇提取光石韦中黄酮的最佳工艺条件，我们选择以总黄酮得率为考察指标，将各考察因素取3个水平进行了L9(34)正交试验，以考察乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间对总黄酮得率的影响。因素水平表见表2。

表2 因素水平表

总黄酮提取正交实验的结果与分析见表3。由表3中极差分析可知，各因素依次为A>B>C>D，以A2B2C2D1最佳。

2.2.2 工艺的验证试验:精密称取脱脂去色的光石韦样品 3份，每份5.0 g。按上述正交试验优选的提取工艺进行提取，再按“2.1.4样品含量测定”项下进行分析，计算总黄酮含量得光石韦中总黄酮的平均含量为6.803%，RSD值为 1.72%(见表4)。

表3 正交实验结果分析

表4 工艺验证试验结果

3 讨 论

黄酮类化合物是一大类天然产物，是石韦等许多中草药的有效成分，具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效[9]。如何利用有限的光石韦资源，得到最高的黄酮产量是很有意义的。本文根据正交设计实验从光石韦中提取总黄酮，其优选的最佳工艺条件为：料液比为1:20的55%乙醇，回流提取2次，每次2 h。测得光石韦中总黄酮的平均含量为6.803%。比文献报道的庐山石韦[7]，石韦[6]中的总黄酮含量高。不同种石韦总黄酮含量存在显著差别，而总黄酮含量的巨大差别启示不同种石韦可能具有不同的药用功效，相关的工作值得进一步研究。

[1]江苏省植物研究所.新华本草纲目(第三册)[M].上海:上海科技出版社,1991:715.

[2]潘炉台,赵俊华,孙庆文.贵州药用蕨类植物[M].贵州:贵州科学出版社,2012:312.

[3]谢来成.武当山药用植物第一卷[M].北京:中国医药科技出版社,2006:98-99.

[4]Parallade J,Guinea M.Flavonoid inhibitors of trypsin and leucineaminopeptidase:A proposed mathematical model for IC50 estimation[J].J Nat Prod,1995,58(6):823-829.

[5]刘昌孝.药物评价学[M].北京:化学工业出版社,2006:107-113.

[6]王自军,杨红兵,齐誉,等.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药,2007,18(2):463.

[7]王瑞兰,易俗,陈康贵,等.庐山石韦中黄酮的提取工艺研究[J].长沙电力学院学报,2003,18(4):84-86.

[8]李晓丹,肖娅萍.5种药用石韦总黄酮的提取及测定[J].中国野生植物资源,2009,28(1):59-61.

[9]索朗其美,达瓦潘多,刘青,等.紫外分光光度法测定西藏野生和人工种植喜马拉雅紫茉莉中总黄酮含量[J].中国民族医药杂志,2012,4:60-62.