宋 军 刘忠义 张平安 戴 晴

胡 潘2 魏欢欢2 杨 洋2

（湘潭大学食品与生物工程系，湖南 湘潭 411105）

草鱼是中国淡水养殖鱼类中产量最高的鱼种，2010年，草鱼产量达到422.22万t［1］。在鱼类加工中，产生大量的包括鱼头、鱼骨、鱼鳞和内脏等下脚料，其中鱼内脏的含量最大。怎样有效利用鱼类加工副产物，减轻环境污染，一直是人们积极探讨的问题。胡卫强等［2］采用气质联用法对草鱼内脏鱼油脂肪酸组成进行了测定，分析结果表明草鱼内脏鱼油可用来制备生物柴油，还有人报道过使用稀碱加钾盐法或酶法从罗非鱼内脏中提取鱼油［3，4］，以及酶解罗非鱼蛋白制取多肽［5］。Aspmo等［6］报道过用酶解鳕鱼内脏得到的水解物作为微生物培养基的成分；Zhou等［7］采用5种商业蛋白酶水解鲍鱼内脏，测定了水解物的体外抗氧化性。然而，提取单一的部分有用物质并不能充分利用鱼内脏，比较好的方法是同时从鱼内脏中获得多种有用物质，乃至最终全部利用鱼内脏，基本消除环境负荷。为了达成上述目的，本试验旨在以草鱼内脏为原料，通过热水自溶法，运用响应面法优化最优水解条件，同时获得鱼油和具有抗氧化活性的水解物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜草鱼内脏：收集于本地菜市场，清洗沥干，匀浆后，20℃ 冷冻储藏备用；

牛血清蛋白：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试剂：均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：WFZ UV－2802SH型，上海尤尼柯仪器有限公司；

数显水浴恒温振荡器：SHA－C型，常州国华电器有限公司；

高速离心机：LG10－2.4A型，北京医用离心机厂；

数显pH计：PHS－3BW型，上海般特仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鱼内脏水解及鱼油提取率的测定 冷冻的鱼内脏4℃下解冻，称取100g原料于500mL的锥形瓶中，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀，密封置于水浴摇床中恒温振荡，转速为200r／min，一定时间后，趁热4 000r／min离心10min，吸取上层油脂，水解液抽滤，制成干燥物备用，残渣待继续处理。鱼油用热的饱和氯化钠溶液洗2次，最后一次用热水洗，分离出上层油，真空干燥得到粗鱼油。鱼油提取率按式（1）计算。

式中：

Y1—— 鱼油提取率，%；

m1—— 提取粗鱼油质量，g；

m2—— 原料粗脂肪质量，g。

1.2.2 RSM优化热水自溶法提油工艺条件 在单因素试验基础上，选取水解温度、水解时间和加水量为自变量，提油率为响应值，采用RSM中的BBD对热水自溶法提油工艺条件进行优化。利用SAS软件设计试验方案，根据该方案进行试验并测定鱼油提取率。单因素试验设计如下：水解温度考察试验设定水解时间60min，加水量60mL，考察温度为50，55，60，65，70℃5个水平；水解时间考察试验设定水解温度60℃，加水量60mL，考察时间为30，45，60，75，90min 5个水平；加水量考察试验设定水解温度60℃，时间60min，考察加水量为40，60，80，100，120mL 5个水平。

将剩余残渣加入适量的蒸馏水匀浆成残渣液，料水比（m∶V）＝1∶4，然后加入2倍体积的石油醚，40℃萃取1h，离心分离出鱼油。

1.2.3 油脂的理化指标测定

（1）酸值：参照GB／T 5530——2005测定；

（2）过氧化值：参照GB／T 5538——2005测定；

（3）碘值：参照GB／T 5532——2008测定。

1.2.4 游离氨基氮测定 采用甲醛电位滴定法［8］。

1.2.5 水解液中多肽得率测定 参照文献［9］的方法。以牛血清蛋白绘制标准曲线，得到牛血清蛋白浓度X与吸光度Y 之间的回归方程为Y ＝0.006 76＋0.242 57 X，R2＝0.999 57。

1.2.6 羟自由基清除能力测定 参照文献［10］的方法，并加以修改。取10mL水解液，加入等体积10%的三氯乙酸，4 000r／min离 心 10min。取 上 清 液 2mL 依 次 加 入9mmol／L水杨酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL，最后加2mL 8.8mmol／L H2O2启动反应。37℃水浴0.5h后，以5%三氯乙酸为参比，在510nm处测定OD值。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol／L水杨酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL、上清液2mL和蒸馏水2mL作为样品的本底吸收值，所有测定值均为3次平均值。清除率按式（2）计算。

式中：

I—— 清除率，%；

A0——空白对照液的吸光度；

AX——加入待测液后的吸光度；

AX0——待测溶液的本底吸收值。

1.2.7 还原能力测定 参照文献［7］的方法，略有修改。取水解液1.0mL依次加入1.0mL 0.2mol／L磷酸缓冲液（pH 6.6）和1.0mL 1%铁氰化钾，置于50 ℃水浴中反应20min后急速冷却，加入1.0mL 10%三氯乙酸，混合后以4 000r／min离心10min。取上清液2.0mL，加入2.0mL蒸馏水和0.4mL 0.1%氯化铁，混匀，静置10min后于700nm测定其吸光值。所有测定值均为3次平均值。

2 结果与分析

2.1 鱼内脏热水自溶水解工艺参数的单因素试验

内脏匀浆程度、pH值、水解温度、水解时间以及加水量（或者料水比）等很多因素会影响鱼内脏的自溶和水解。内脏匀浆能充分破坏内脏的组织结构，有利于内脏的自溶过程能尽快顺利完成，然而过度匀浆也可能导致内脏匀浆物黏度太大，动力消耗急剧增加。pH值会影响酶的活性，一般来说，应该是非常重要的影响因素。但是，在试验中发现高的或者低的pH值会导致鱼油皂化或者酸值增加，而对鱼油提取率的影响并不大，因此草鱼内脏自溶水解时采用内脏匀浆液的自然pH值（pH 6.2～6.4）。经过初步筛选后，选择水解温度、水解时间以及加水量3个因素做进一步的研究。

2.1.1 水解温度对提油率的影响 由图1可知，当水解温度为50～60℃时，随着温度的升高鱼油提取率迅速增加，这可能是因为温度升高加大蛋白质变性以及内源酶对蛋白质的水解，利于原料中油脂的释放，温度为60℃鱼油提取率达到最大值，随后鱼油提取率随着温度升高而降低。而游离氨基氮含量在50～55℃逐渐增加，55℃达到较大值，继续增加温度，游离氨基氮含量减小，这可能与草鱼内脏内源酶失活有关。由于鱼油特别容易氧化，必须尽可能多的将内脏中鱼油提取出来，因此以鱼油提取率为主要考量，结合水解液中游离氨基氮的变化，选择60℃为较优的提取温度。

2.1.2 水解时间对提油率的影响 由图2可知，随着水解时间的延长鱼油提取率逐渐增加，当水解时间为60min时鱼油提取率增加不明显，水解液中游离氨基氮含量也趋缓。综合考虑，75min可能为较佳的水解时间。

2.1.3 加水量对提油率的影响 由图3可知，鱼油提取率随着加水量的增加而增加，加水量为60mL时达到较大值，加水量继续增加，提取率逐渐降低。综合考虑，选择60mL为合适加水量。

图1 水解温度对提油率和游离氨基酸的影响Figure 1 Effects of temperature on fish oil extraction and free amino nitrogen

图2 提取时间对鱼油提取和游离氨基氮的影响Figure 2 Effects of extraction time on fish oil extraction and free amino nitrogen

图3 加水量对鱼油提取和游离氨基氮的影响Figure 3 Effects of water addition on fish oil extraction and free amino nitrogen

2.2 水解工艺参数的响应面优化

2.2.1 因素水平的选取及试验结果 根据Box－Beknhen中心组合试验设计原理，选取水解温度、水解时间与加水量3个因素，以提油率为响应值 （Y1）。 因子编码及各自变量水平见表1，试验设计及结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立及方差分析 运用SAS软件对响应值进行回归分析，经拟合得到二次多项回归方程：Y1＝62.903 33 ＋10.522 5 X1＋13.697 5 X2－ 9.572 5 X3－5.461 667 X21－10.915 X1X2＋3.52 X1X3－8.771 66 X22－0.72 X2X3－7.806 667 X23，回归分析结果见表3。由表3可知，R2＝98.67%，Ra2dj＝96.29%，表明因变量与自变量之间的线性关系良好，模型的P值远小于0.01，模型显著，失拟项在α＝0.05水平上不显著（P＝0.124 3＞0.05），表明各因素值和响应值间的关系可以用此模型函数化，对响应值作用显著的有 X1、X2、X3、X21、X22、X23、X1X2，对提油率影响的因素依次是水解时间、水解温度和加水量，即水解时间对提油率影响最明显。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Analytical factors and levers for RSA

表2 Box－Beknhen中心组合试验结果Table 2 Experimental designs and results of oil extraction

模型的响应面图见图4。由图4（a）可知，水解时间和温度的交互作用显著，图4结果和表3数据分析结果吻合。由图4（b）可知，在选定的范围内保持X1（水解温度）定值时，随着X3（加水量）的增加提油率先增大后减少，同样保持X3为定值时，随着X1的增加开始阶段提油率迅速增加，随后趋缓。与回归分析结果相符，水解温度和加水量的交互作用不显著。由图4（c）可知，水解时间和加水量的交互影响不显著，与统计结果相符。

为进一步验证最佳点的值，将所得回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零可得一个三元一次方程组：

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

解之得X1＝0.186，X2＝0.925，X3＝ －0.698

代入变换公式即得水解温度为59℃，水解时间为74min，加水量为56mL，该提取条件下，由回归方程预测提油率的理论值为71.60%。在该条件下进行3平行验证实验，得到的结果为平均提油率68.34%，标准差±0.89%。验证值与预测值较为吻合，说明该模型的拟合程度较好。

2.3 鱼油的理化性质

鱼油的酸值、过氧化值和碘值见表4。因测定残渣油脂含量较高，故对残渣石油醚萃取油脂。由表4可知，只需对粗鱼油适当精制，鱼油理化性质就能达到中国二级粗鱼油国家标准。

表4 油脂的理化性质Table 4 Physical and chemical properties of fish oils

2.4 水解物的抗氧化活性测定

测定最优工艺条件下水解液的抗氧化活性，并以未发生热水自溶水解的匀浆液比较。由表5可知，匀浆液表现出一定的抗氧化活性，这可能与鱼类蛋白源中促氧化剂［11］（包括亚铁血红素蛋白和磷脂）的存在有关。较之匀浆液，每10mg干物质的水解液羟自由基清除率增加，达到（18.68±1.80）%。

图4 各因素交互影响的响应面图Figure 4 Response surface plot on interactive effects of various factors

表5 水解物的抗氧化活性†Table 5 Antioxidant activity of hydrolysate

试验测定，草鱼内脏和水解液粗脂肪含量分别为734.54，14.38mg／g干物质。绝大部分鱼油被抽提出来，剩余鱼油一部分存在于残渣的乳状液、另一部分为与蛋白质结合的油脂，故分离水解液后的剩余残渣再经过简单处理，也可以干燥后制作成饲料。

3 结论

利用RSM优化热水自溶法水解提油条件为水解温度59℃，水解时间74min，加水量56mL，在该条件下试验测定值为（68.34±0.89）%，与预测值（71.60%）较吻合。通过热水自溶，可以从鱼内脏中获取鱼油和具有抗氧化活性的水解液，剩余残渣也可以制作成饲料。

1 农业部渔业局编制.2011中国渔业统计年鉴［M］.北京：中国农业出版社，2011：4.

2 胡卫强，宋军，刘忠义.利用GC／MS分析草鱼内脏鱼油和菜籽油的脂肪酸组成［J］.食品与机械，2011，27（5）：48～51.

3 高加龙，郝记明，刘书成，等.罗非鱼内脏鱼油提取与精炼工艺研究［J］.科技信息，2009（20）：4～6.

4 白洋，孙忠义，杨思华，等.Alcalase酶酶解罗非鱼加工下脚料提油工艺研究［J］.食品工业，2010（6）：26～28.

5 丁利君，黄小梅，何颖基.罗非鱼蛋白制取多肽条件的优化［J］.食品与机械，2008，24（2）：15～18.

6 Aspmo S I，Horn S J，Eijsink V G H.Hydrolysates from Atlantic cod （Gadus morhua L.）viscera as components of microbial growth media［J］.Process Biochemistry，2005，40（12）：3 714～3 722.

7 Zhou D Y，Zhu B W，Qiao L，et al.In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone（Haliotis discus hannai Ino）viscera［J］.Food and Bioproducts Processing，2012，90（2）：148～154.

8 王永华.食品分析［M］.北京：中国轻工业出版社，2010：138～140.

9 郭红英.麦胚蛋白酶解物的制备及其抗氧化功能研究［D］.镇江：江苏大学，2009.

10 陈留勇，盂宪军，贾薇，等.黄桃水溶性多糖的抗肿瘤作用及清除自由基提高免疫活性研究［J］.食品科学，2004，25（2）：167～170.

11 Khantaphant S，Ghomi M R，Benjakul S.The effects of pretreatments on antioxidative activities of protein hydrolysate from the muscle of brownstripe red snapper （Lutjanus vitta）［J］.LWT－Food Science and Technology，2011，44（4）：1 139～1 148.