申艳红，陈晓静

（福建农林大学 园艺学院，园艺植物遗传育种研究所，福建 福州 350002）

为了适应基因工程和基因组学的快速发展，在遗传实验教学中增加了“植物基因组DNA的粗提与鉴定”实验［1］。但是该实验为验证性实验，学生只能按部就班地完成实验步骤，学生处于被动接受的地位，不利于培养学生的分析问题和解决问题的能力［2］；而且这样的实验不能说明任何生物学问题，学生积极性不高。为了更好培养学生的实践动手能力、创新设计能力和科学研究能力，设计了“番木瓜DNA提取与性别分子鉴定”综合性实验。该实验将基因组DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和分子标记分析整合到一个实验中。通过对本实验的操作，学生学习了移液枪、离心机、PCR仪和电泳仪等常用分子遗传学研究仪器的使用方法，了解基因工程和基因组学研究的基本方法。而且通过本实验，学生可以清楚认识到分子标记辅助选择的神奇功能，简单的PCR操作就可以将番木瓜的两性株和雌株分辨开，大大地激发了学生的学习兴趣。

1 材料

植物材料：实验用新鲜番木瓜叶片采自福建农林大学校园。

试剂：SDS、CTAB、Tris、EDTA、NaCl、PVPP、乙醇、氯仿和异戊醇均为国产分析纯；ExTaq、dNTPs等购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京天泽基因工程有限公司。

2 实验方法

2.1 DNA提取

（1）改良2×CTAB法。参照植物基因工程［3］的方法，并加以改进。

① 取番木瓜叶片0.1g并剪碎放入研钵中，加入1 mL提取缓冲液（0.02g／mL CTAB，1.4mol／L NaCl，20 mmol／L EDTA，100mmol／L Tris－HCl），加少许PVPP，充分研磨至浆糊状；然后用1mL提取缓冲液将糊状物洗入2mL的离心管中，65℃水浴15min。

②4℃、13000r／min离心10min。

③ 取上清，加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇，剧烈振荡，4℃、13000r／min，离心10min。

④取上清，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻向一个方向转动试管，可见有白色絮状沉淀出现，即为DNA。

⑤ 用枪头将絮状物挑出到1.5mL离心管中，用500μL、75%乙醇洗涤沉淀，4℃、10000r／min，离心5min。

⑥ 用移液枪吸取上清，弃掉，放在50℃烘箱中5min，以除去乙醇。

⑦ 加入50～100μL ddH2O溶解沉淀，－20℃保存备用。

（2）SDS－KAc小量提取法。参照何玮毅等［4］的方法，并简化了步骤。

① 称取番木瓜叶片0.1g，加入1500μL、缓冲液 （500mmol／L NaCl；pH 8.0 的 100mmol／L Tris－HCl；50mmol／L EDTA），加少许PVPP，迅速研磨成匀浆，转移至2mL离心管中，加入100μL 20%SDS，65℃温育15min。

② 加入300μL KAc，放入4℃冰箱10min，4℃、13000r／min离心10min；之后步骤同方法（1）的③—⑦步。

（3）2×CTAB＋质粒提取试剂盒法。将番木瓜叶片于2×CTAB缓冲液中研磨成匀浆，65℃温育15 min后，离心，然后将上清液加入质粒提取试剂盒的柱子中，其余步骤参照试剂盒使用说明书。

（4）SDS－KAc＋质粒提取试剂盒法。完成方法（2）的①、②步后，将上清液加入质粒提取试剂盒的柱子中，其余步骤参照试剂盒使用说明书。

2.2 DNA质量检测

取3μL DNA样品并稀释100倍，在TU－1901型紫外分光光度计上测定A260、A280，并计算检测DNA的纯度、浓度和产率。计算 DNA浓度c：c／（mg·L－1）＝A260×50×100。各取8μL DNA样品，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。各取8μL DNA样品用Sau3AI与EcoR I酶切，将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

2.3 番木瓜性别连锁SCAR标记的扩增

根据Deputy等［5］发表的番木瓜性别连锁SCAR标记合成引物，上游引物 T12－F：5′－GGGTGTGTAGGCACTCTCCTT－3′，下游引物 T12－R：5′－GGGTGTGTAGCATGCATGATA －3′，片段长度为800bp。利用番木瓜Actin基因保守区做阳性对照［6］，上游引物为5′－CACTGCTGAGCGGG AAATTGT－3′，下游引物为5′－GATCCTCCAATCCAGACACTGT－3′，片段长度为426 bp。以提取的番木瓜基因组DNA为模板，扩增性别连锁SCAR标记。PCR扩增程序：94℃预变性5min；35个扩增循环的94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s；最后72℃继续延伸7min。扩增PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3 实验结果及4种DNA提取方法的比较

由电泳结果可以看出，4种方法提取的番木瓜基因组DNA条带完整、清晰，说明没有降解。2×CTAB法和SDS－KAc法DNA的得率比与试剂盒结合的方法高，但是这2种方法RNA污染严重，而且点样孔稍亮，说明有蛋白质污染（见图1）。采用分光光度计测定OD值，2×CTAB法与SDS－KAc法提取的DNA A260／A280接近2，A260／A230均为2.16（见表1）。如果单从数据上看，这2种方法提取的DNA质量很高，没有RNA、蛋白质以及小分子杂质的污染。但是从DNA电泳图谱已经看出，这2种方法获得的仅是粗提DNA，既有RNA污染，又有蛋白质污染，因此粗提得到的DNA不适于用分光光度法分析其质量。Sau3AI与EcoR I酶切结果表明，采用这4种方法提取的DNA均能被完全酶切（见图2）。分别以这4种方法提取的DNA为模板，扩增番木瓜Actin保守区，均能扩增出目的条带（见图3），说明4种方法所提取的DNA质量可以满足PCR扩增的要求。

表1 番木瓜叶片DNA的紫外分光光度计测定结果

图1 番木瓜DNA电泳图谱

图2 番木瓜DNA的Sau3AI和EcoRI酶切

图3 番木瓜Actin基因的扩增

采用2×CTAB法分别提取了两性株与雌株的基因组DNA，分别扩增番木瓜Actin基因和SCAR性别连锁标记。将PCR产物跑电泳，结果如图4所示，两性株和雌株都能扩增出Actin基因，但是只有两性株能扩增出SCAR标记，说明SCAR标记仅出现在两性株的基因组中，因此PCR扩增可以鉴定番木瓜性别。

图4 番木瓜性别连锁SCAR标记的扩增

4 讨论

番木瓜株性复杂，有雄株、雌株和两性株，是研究植物性别决定的模式植物。早在20世纪30年代，Hofmeyr［7］和Storey［8］就推断番木瓜的性别受3个复等位基因控制，雄株、两性株及雌株的基因型分别为M1m、M2m、mm。Horovitz和Jimenez［9］根据属间杂交的结果提出番木瓜性别是由性染色体决定的，属于经典的XXXY型。随着研究的深入，Liu等［10］认为番木瓜包含一个原始的Y染色体，其雄性特异区域可能与2亿4千万到3亿2千万年前人Y染色体的祖先相似。

番木瓜雄株一般不结果，雌株和两性株均能结果，但是雌株果实果腔大、果肉薄，市场价值不如两性株果实。番木瓜性别分化较迟，一般在开花后才能准确鉴别其性别，因此在生产中果农总是1个穴中种2～3株小苗，等到7～9个月开花后再将雄株和雌株拔掉，这在生产上造成极大的浪费［11］。因此，番木瓜性别早期鉴定在番木瓜生产上具有重要意义。Deputy等［5］获得了与番木瓜性别紧密连锁的2个RAPD标记，并将其转化为SCAR标记。SCAR T12在两性株上能扩增出约800bp的特异条带，而在雌株中不出现，重复性良好，能很好地将两性株和雌株区分开，在生产上具有重要应用价值。

番木瓜是热带、亚热带常种果树，在我国广东、广西、云南、台湾、福建等地广泛种植［12］。在福州，番木瓜全年开花，雌花没有雄蕊，花型胖大，两性花既有雌蕊又有雄蕊，花型瘦小，容易分辨，方便学生自己动手采集、处理材料，完成实验全过程。

常规植物组织DNA提取方法中，一般将植物组织放在液氮中研磨成粉末，这样有利于抑制DNAase的作用，以防DNA降解。在我们所用的4种方法中均没有使用液氮，因为液氮价格较贵，而且易挥发，不容易保存。本研究中，将番木瓜叶片直接放在提取缓冲液中，室温下进行研磨，未见DNA降解，效果良好。实验证明，4种方法提取的DNA虽然都有些杂质污染，但是可以进行PCR扩增、酶切鉴定等实验。4种方法与传统DNA提取方法［3］相比，简化了多个实验步骤，因此大大节约了操作时间。传统DNA提取大约2h，而这4种改进方法只需约1h就可以完成。2×CTAB法比SDSKAc法少1个步骤，可以节约10min时间。与试剂盒结合的方法又比上面2种方法节约10min时间。因此，如果没有时间上的考虑，完全可以选用前面2种传统方法，而且全部用的是常规药品，价格便宜。其实，植物基因组DNA提取试剂盒种类很多，效果也不错，作者之所以选用质粒提取试剂盒，也是出于价格的考虑。天泽柱式植物DNA提取试剂盒50次包装的价格为390元，而天泽柱式质粒提取试剂盒100次包装的价格仅为99元。因此，在教学经费短缺，又想让学生感受柱式植物DNA提取时，采用2×CTAB或SDS－KAc＋质粒提取试剂盒法是不错的选择。

（References）

［1］申艳红，陈晓静.适合本科教学的“DNA粗提与鉴定”实验［J］.生物学通报，2008，43（12）：33－34.

［2］皮妍，林娟，郭滨，等.改革遗传学实验教学方法培养新型创新人才［J］.实验室研究与探索，2008，27（10）：86－88.

［3］王关林，方宏筠.植物基因工程［M］.2版.北京：科学出版社，2005：755.

［4］何玮毅，陈晓静，申艳红，等.番木瓜组培苗叶片基因组DNA的微量提取［J］.福建农林大学学报：自然科学版，2009，38（1）：34－38.

［5］Deputy J C，Ming R，Ma H，et al.Molecular markers for sex determination in papaya（Carica papayaL）［J］.Theor Appl Genet，2002，106（1）：107－111.

［6］申艳红，陈晓静，何玮毅，等.番木瓜肌动蛋白CpActin基因的克隆及在果肉中的表达研究［J］.果树学报，2010，27（6）：859－862.

［7］Hofmeyr J D J.Genetical studies of Carica papayaL［J］.South African Department of Agriculture and Science Bulletin，1938，187：64.

［8］Storey W B.Segregation of sex types in Solo papaya and their application to the selection of seed［J］.American Society for Horticultural Science Proceedings，1938，35：83－85.

［9］Horovitz S，Jim nez H.Cruzamientos interespecificos e intergenericos en caricaceas y sus implicaciones fitotechicas［J］.Agron Trop，1967，17：323－343.

［10］Liu Z Y，Moore P H，Ma H，et al.A primitive Y chromosome in papaya marks incipient sex chromosome evolution［J］.Nature，2004，427：348－352.

［11］Urasaki N，Tokumoto M，Tarora K，et al.A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya（Carica papayaL）［J］.Theor Appl Genet，2002，104（2／3）：281－285.

［12］华南农业大学.果树栽培学各论［M］.北京：中国农业出版社，1989：243.