程吕欢 徐建军 魏益平 胡欣春

（1江西省胸科医院 南昌 330006；2南昌大学第二附属医院 南昌 330006）

CD44、CD133在肺癌组织中的表达及临床意义

程吕欢1、2徐建军2魏益平2胡欣春1

（1江西省胸科医院 南昌 330006；2南昌大学第二附属医院 南昌 330006）

目的：探讨CD44和CD133在肺癌组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法：选取南昌大学第二附属医院胸外科2012年6～12月未接受过放疗、化疗且行肺癌根治术患者的新鲜肺癌组织标本40例，同时收集相应癌旁组织(距癌组织5 cm的非癌组织)，采用RT-PCR法检测40例肺癌组织及其癌旁组织中CD44、CD133的mRNA表达情况。结果：CD44基因阳性表达率分别为85.0%(34/40)，60.0%(24/40)；CD133基因阳性表达率分别为 72.5%(29/40)，30.0%(12/40)。 CD44、CD133基因在肺癌组织中表达水平高于癌旁组织（χ2=6.270，P=0. 012；χ2=14.459，P=0.000），鳞癌中表达高于腺癌。结论：CD44、CD133基因高表达可能是促进肺癌发生发展的因素之一。

肺癌；CD 44；CD 133；肿瘤干细胞

肺癌发病率高，恶性程度大，在所有恶性肿瘤中，非小细胞肺癌（non-sma11-ce111ungcarcinoma,NSCLC）的病死率在世界上居第1位[1]，目前，NSCLC的主要治疗是以手术切除、辅以术后化放疗等多学科的综合治疗，而五年生存率不超过15%。越来越多的研究证明，恶性实体瘤内存在着一小部分成瘤能力特别强、分化程度特别低的细胞，被称之为肿瘤/癌干细胞（tumor/cancer stem ce11s TSC/CSC），该类细胞的特征：自我更新能力、多向分化潜能及强大的动物体内成瘤能力，尽管在癌组织中，这类细胞的数目极少，但是，在肿瘤的发生、发展和转移中却发挥了关键作用，且是肿瘤逃避常规治疗手段，最终导致复发的罪魁祸首。

对于肺癌肿瘤干细胞特征性标志物的分选，国际上尚无一致标准，CD44是乳腺癌干细胞的标志物，CD133是脑肿瘤等实体瘤干细胞的标志物，上述肿瘤中CD133阳性细胞的成瘤性明显较阴性组强。本研究选择检测CD44、CD133在肺癌及癌旁正常组织的表达水平，探讨其与肺癌病理组织类型、分化程度等临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集南昌大学第二附属医院胸外科2012年6～12月行肺癌根治术患者的新鲜肺癌组织标本40例（且未接受过放疗、化疗），同时收集相应癌旁组织（距癌组织5 cm的非癌组织），所有组织标本均术中冰冻确诊为恶性，30 min内立即取材置于-80℃低温冰箱保存备用；术后石蜡切片证实为肺癌，癌旁组织均证实为不含癌的肺组织。分别将40例肺癌组织设为实验组，相应的癌旁肺组织设为对照组。40例肺癌患者中，有淋巴结转移的21例，无淋巴结转移的19例；鳞癌32例，腺癌8例；男23例，女 17例；年龄 37～78岁，平均年龄（58.79±10.39）岁，年龄≥60岁19例，＜60岁21例；高分化19例，中分化13例，低分化8例；按2009工ASLC国际肺癌分期标准（第七版）进行TNM分期：浸润深度T1～T2 25例，T3～T4 15例。

1.2 主要试剂 Trizo1总RNA提取试剂（美国Invitrogen公司），琼脂糖（西班牙 biowest公司），Ex Taq HS DNA聚合酶（北京鼎国生物工程有限公司），50bp DNA Marker（北京赛诺基因组研究中心有限公司），逆转录kit（美国Fermentas公司），Tap DNA po1ymerase（日本东洋纺 TOYOBO公司），DNTP（北京赛诺基因组研究中心有限公司），引物合成（北京赛诺基因组研究中心有限公司）。

1.3 主要仪器 SS-325高压灭菌消毒锅（日本TOMY），DYY-Ⅲ型稳压电泳仪（上海六一仪器），凝胶数字成像系统（美国Bio-Rad公司），多通道PCR扩增仪（美国MJ公司），高速低温离心机（德国Heraeus公司），-80℃低温冰箱（德国Thermo Forme公司），紫外分光光度计（美国UVC-515），梯度PCR扩增仪（美国MJ）。

1.4 方法 RT-PCR法将抽提的细胞总RNA逆转录成cDNA，使用Primer5.0软件和参考有关文献，设计PCR引物（表1）。PCR扩增条件：Taq Mixture(各 2.5 mm)12.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL，10 μmo1/L上游引物 1.0 μL，10 μmo1/L，下游引物 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，总体积 25 μL，混匀，6 000 转 /min 瞬时离心，PCR扩增仪上扩增，分析 PCR产物，在BIO-RAD凝胶数字成像系统上观察结果并照相，用凝胶成像系统Quantity One软件分析。判断基因表达标准：CD44、CD133基因在同一份标本中均有目标扩增条带，条带所在的位置在DNA Marker的对照下与引物设计的扩增片段长度一致，判断为该标本 CD44、CD133 基因表达；CD44、CD133 mRNA 表达的检测：以检测到清晰的条带作为有表达，记为“+”，没有表达记为“一”，用相应的癌旁正常肺组织作为对照。

表1 CD44、CD133引物序列和扩增产物长度

1.5 统计学分析 采用SPSS17统计软件包进行数据处理，计数资料两样本率的比较采用卡方检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌及癌旁组织中CD44、CD133基因表达应用RT-PCR检测NSCLC肺癌组织及癌旁组织CD44 基因，获得基因片段为 195 bp，Lane 1、3、5、7、9 为肺癌组织；Lane 2、4、6、8、10 为癌旁组织，Lane1、3、4、7 为阳性表达，Lane 2、5、6、8、9、10 为阴性表达；应用RT-PCR检测NSCLC肺癌组织及癌旁组织CD133基因，获得基因片段为111 bp，Lane 1、3、5、7、9 为肺癌组织，Lane 2、4、6、8、10 为癌旁组织，Lane1、3、4、5、7 为阳性表达，Lane 2、6、8、9、10为阴性表达。

2.2 CD44、CD133 mRNA在肺癌组织中表达的阳性率 肺癌及癌旁组织中CD44基因表达率为85.0%(34/40)、60.0%(24/40)；CD133 基因表达率为72.5%(29/40)、30.0%(12/40)；CD44、CD133 基因在肺癌组织中表达水平高于癌旁组织（χ2=6.270，P=0. 012；χ2=14.459，P=0.000），P＜0.05，差异有统计学意义。见表2。

2.3 CD44、CD133基因在肺癌组织中的表达与临床病理学指标的关系 CD44、CD133 mRNA在肺癌中的表达水平与患者性别、年龄、吸烟状况、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、浸润深度无相关性(P＞0.05)，肺鳞癌中的表达高于腺癌（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

最初CD133抗原被发现在人胎肝、骨髓、脐血及外周血CD34造血细胞中选择性表达，研究证实[2]来源于人结直肠癌细胞株的HCT116肿瘤细胞球中富含CD133细胞，CD133表面标志定位于细胞膜，细胞球更强的转移能力可能通过上皮-间质转化而获得。魏益平等[3]研究表明，CD133在肺癌标本中的阳性表达与患者的淋巴转移和肿瘤预后密切相关，CD133在原始细胞分化为成熟细胞后表达量均下降。Kim等[4]于2005年在NSCLC小鼠模型中，从其最早阶段的肿瘤中分离得到一种细胞，将其命名为支气管肺泡干细胞 (bmchioa1veo1ar stem ce11s，BASCs)。正常情况下，BASCs处于静止状态，在体内支气管和肺泡受到损伤时，其则发生增殖，BASCs自我更新特性明显，逐渐分化成其它类型的肺上皮细胞，从而表现出了干细胞特性，因此，他们认为远端肺上皮的干细胞为BAsCs。Janikova等[5]通过对121个非小细胞肺癌（NSCLC）患者肺癌组织样本检测干细胞标记物CD133和巢蛋白的表达，CD133的阳性表达为19%，巢蛋白在上皮中的阳性表达为66%，共同表达为17%，因此认为CD133是肺癌干细胞的潜在标记。Iida等[6]研究显示CD133在肺癌N417、H358、A549细胞株中表达水平明显上调。Hi1be等[7]研究认为，在非小细胞肺癌中，CD133表达明显增加，而病人的肿瘤血管发生与肿瘤增长与之密切相关，CD133可能就是肺干细胞的表面标志。Tirino等[8]研究了89例非小细胞肺癌(NSCLC)患者，使用流式细胞仪检测活体肿瘤细胞，发现其中72%表达CD133，且CD133阳性肺癌细胞在糖尿病及免疫缺陷小鼠中有更强的成瘤能力。本研究表明在肺癌组织中CD133表达高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），与既往研究结果相符，且与患者性别、年龄、吸烟状况、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、浸润深度无相关性(P＞0.05)。

表2 CD44、CD133 mRNA在肺癌及癌旁组织中的表达情况 例

表3 CD44、CD133mRNA在肺癌组织中的表达与临床病理学指标的关系 例

CD44属于粘附分子家族，为一种表面跨膜糖蛋白，多种配体分子能与其结合，主要参与细胞与细胞外基质间、细胞与细胞间的粘附及肿瘤转移过程，CD44又称白细胞分化抗原分化群第44号(c1uster of differ-entiation 44，CD44)，于 1980 年被首次发现并确认，CD44参与细胞-细胞、细胞-基质之间的相互作用，主要作用在于维持细胞外基质的完整性和稳定细胞内环境。CD44基因在肺癌中表达情况，既往的研究结果不尽相同。Takahashi等[9]发现NSCLC中CD44s的表达显著低于周围的正常肺组织，肿瘤细胞逃避人体免疫可能与CD44s的减少有关。Tran等[10]分别研究了49例鳞癌和49例腺癌后发现，CD44s、CD44v6在腺癌中的表达水平显著低于鳞癌。相反，Sa1mi等[11]用免疫组化方法研究肺鳞癌组织进行发现，CD44v6在正常鳞状细胞胞浆、胞膜中强表达，而CD44v6在大部分鳞癌组织中表达缺失。CD44在肺癌转移中的作用尚存争议，Situ等[12]研究71例病人的结果显示，CD44v6在鳞癌中的高表达，表达率53.6%，术后生存率较佳，以1B期鳞癌明显，经多元分析证实，CD44v6是肺癌的一个独立的预后指标，CD44低表达的肺癌细胞有更长的寿命，Afify等[13]对52例NSCLC患者及15例SCLC患者进行研究，所有鳞癌组织中CD44s和CD44v6均有表达，腺癌中CD44s阳性表达率39%，CD44v6阳性表达率45%，类癌中仅CD44s表达，表达率88%，所有小细胞肺癌中CD44s和CD44v6均阴性表达，腺癌组织中CD44s与淋巴结转移呈正相关，CD44v6则与肿瘤大小关系更为密切。Ko等[14]研究显示CD44s与淋巴结转移，肿瘤分化程度明显相关，可作为肿瘤患者预后不良指标。本研究表明，CD44在肺癌组织中高表达，且鳞癌中的表达高于腺癌（P＜0.05），与患者性别、年龄、吸烟状况、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、浸润深度无相关性(P＞0.05)。

本课题通过对CD44、CD133在肺癌组织中的表达研究，探讨其与肺癌生物学行为之间的关系，两项指标均在肺癌组织中高表达，与癌旁组织比较差异有统计学意义（P＜0.05），CD44、CD133基因高表达可能是促进肺癌发生发展的因素之一；CD44、CD133基因在肺鳞癌中的表达高于腺癌（P＜0.05），可能与其在上皮组织中的高表达有关。CD133、CD44在肺癌组织中的表达具有一致性，这为进一步研究CD44、CD133双阳性肺癌细胞的致瘤性提供了一个方向。

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B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.04.036

2013-03-07）