黄种新 杜好信 姚成才

（1福建中医药大学2006级本硕连读研究生 福州 250122；2福建中医药大学附属厦门市中医院 厦门 361009）

柴胡对人食管癌细胞株Eca-109的抑制作用*

黄种新1杜好信2姚成才2

（1福建中医药大学2006级本硕连读研究生 福州 250122；2福建中医药大学附属厦门市中医院 厦门 361009）

目的：探讨中药柴胡对人食管癌细胞株Eca-109的抑制作用。方法：体外培养人食管癌细胞株(Eca-109)，分别给以不同浓度的柴胡溶液对体外培养的Eca-109细胞株进行干预。以MTT比色法测定柴胡溶液对Eca-109细胞株的抑制增殖的作用，计算其细胞增殖存活率。结果：MTT实验显示柴胡溶液可以明显抑制Eca-109细胞株的增殖。用药后Eca-109细胞增殖存活率下降幅度与剂量呈正相。结论：中药柴胡在体外具有抗肿瘤作用，其机制是抑制肿瘤细胞增殖，及抑制细胞的分化而达到抗肿瘤的目的。

柴胡；食管癌细胞；抑制作用

柴胡始载于《神农本草经》，为伞形科植物，是我国的传统中药和常用中药，其性味苦凉，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效。用于治疗寒热往来、胸满胁痛、口苦耳聋、头痛目眩等[1]。柴胡主要成分为柴胡皂苷（saikosapoins a、b、c、d 四种）、甾醇、挥发油、脂肪酸和多糖等。有文献报道了有关柴胡皂苷抗肿瘤作用的研究成果[2]。本研究以人食管癌Eca-109细胞为材料，观察中药柴胡对这种细胞株生长的影响作用。旨在探索柴胡对人食管癌细胞株的抑制作用，为进一步研究其抑制作用及指导临床实践提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 人食管癌细胞株Eca-109，购自上海细胞库。

1.2 主要化学试剂 MTT购置于Sigma公司，胎牛血清购置于杭州试剂生物工程材料有限公司，青霉素购置于厦门泰京有限公司。

1.3 仪器 培养箱（REVCO）、酶联免疫检测仪（KHB）、高速离心机、普通离心机、XHQ-A型旋涡混合器、DK-8D型电热恒温水箱、UNO-II型PCR扩增仪（Biemetra）、DYY-IIITB 型水平电泳仪、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、流式细胞仪、隔水式电热恒温箱、震荡混匀器、恒温干燥箱等。

2 方法

2.1 细胞培养 人食管癌细胞株Eca-109在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞长满培养皿底80%～90%时，进行传代，传代时吸除培养基，用PBS缓冲液洗两次，0.5 mL 0.25%胰酶进行消化。根据实验需要，将细胞接种于不同规格的培养板中进行培养。将柴胡溶液溶于未加胎牛血清的RPMI1640培养基中，配制成0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的浓度用于实验。

2.2 细胞增殖存活率测定（MTT法） 将对数生长期的细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/L，接种于96孔培养板内，每孔100 μL(每孔5×103个细胞)；细胞接种24 h后，开始加入药物进行处理（不同浓度）；每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h；吸除MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO；脱色摇床摇动10 min后，酶标仪检测波长为490 nm时各孔OD值；根据公式：细胞抑制率=（OD对照组－OD给药组）/OD对照组×100%计算出各组细胞的增殖存活率。

2.3 统计学处理 采用Origin7.5软件对实验数据进行统计学处理，所有数据以(±S)表示，进行单因素方差分析及其他相关统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 实验结果

采用MTT法测定Eca-109经不同浓度中药柴胡溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）处理 24 h后的细胞增殖存活率。从表1结果可以看出，与对照组相比，不同浓度柴胡溶液组均有统计学差异。Eca-109在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的柴胡溶液作用 24 h 后其细胞增殖存活率呈明显的递减趋势。说明柴胡溶液在体外对Eca-109具有明显的存活抑制作用，它们的增殖存活率与柴胡溶液呈明显的剂量依赖关系。

表1 不同浓度柴胡溶液处理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

表1 不同浓度柴胡溶液处理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

组别 Eca-109增殖存活率 P值对照组0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 2.0 mg/mL 100 75.56±7.30 57.74±10.51 55.95±12.40 26.35±6.55＜0.05＜0.05＜0.01＜0.01

4 讨论

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。全世界每年有20余万人死于食管癌，我国每年死亡达15万人，占据世界食管癌死亡人数的大部分。在我国，食管癌发病率男性居各种恶性肿瘤第四位，女性为第七位，而死亡率男女均居第四位。尽管国内外医学工作者经过几十年的探索实践，在食管癌的防治方面取得很大的成绩，但食管癌的具体发病机制仍然不十分清楚，以手术、化疗、放疗为主的综合治疗手段仍不尽如人意，尤其在药物治疗方面，食管癌对化疗药物敏感性很差，化疗效果有限，食管癌的预后仍较差。当前的研究显示，食管癌缺乏对各种常见抗肿瘤药物的敏感性，导致其化疗的疗效低下。近年来，由于分子生物学在医学研究领域的广泛应用，各种分子靶点治疗药物的开发研究犹如雨后春笋，令包括食管癌在内的恶性肿瘤防治研究展现出新的活力。本研究证实中药柴胡在体外具有抗肿瘤作用，为未来开发出相关新的、效果明显的食管癌化疗药物或者新的辅助化疗药物提供理论基础。

国内外学者也对柴胡的抗肿瘤作用做了临床和实验研究。陈静波等[3]、夏薇等[4]通过给予不同浓度的柴胡皂苷d(SSd)分别作用于HL-60细胞以及K562细胞时发现，SSd对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖关系；Chiang等[5]研究发现SSd通过激活Caspase(胱门冬蛋白酶)3和7，引起多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶(po1y-ADP-ribose-po1ymerase,PARP)的分裂从而诱导人肝癌细胞HepG2凋亡。Hsu等[6～7]发现SSd对引起细胞凋亡的受体Fas和Fas配体的表达均有明显的促进作用，可引起G1期细胞的堆积。刘殿菊等[8]应用血清药理学方法在体外证实了柴胡含药血清的抗肿瘤活性。

本研究结果显示：柴胡溶液对Eca-109细胞有明显的抑制作用，且与剂量相关，柴胡溶液的抑制作用随浓度增加而增加(P＜0.05)。说明柴胡溶液在体外对食管癌细胞的生长增殖有明显的抑制作用，有可能是一种有希望的抗癌中药。随着分子生物学技术的不断发展，必将对中药柴胡及类似药物抗肿瘤抑制作用的研究起到很大的推动作用，针对这些机制的研究有希望开发出新型的抗肿瘤药物。

[1]李家邦.中医学[M].北京:人民卫生出版社,2006.138-139,223

[2]王艳丽,和水祥,罗金燕.柴胡皂苷抗肿瘤机制研究进展[J].中西医结合学报,2006,1(4):98-100

[3]陈静波,夏薇,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)对HL-60细胞增殖的抑制作用[J].北华大学学报:自然科学版,2001,2(6):486-488

[4]夏薇,崔新羽,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)对K562细胞增殖的抑制作用[J].北华大学学报:自然科学版,2002,3(2):113-115

[5]Chiang LC,Ng LT,Liu LT,et a1.Cy-totoxicity and anti-hepatitis B virus activities of saikosaponins from Bup-1eurum species[J].P1anta Med,2003,69(8):705-709

[6]Hsu YL,Kuo PL,Chiang LC,et a1.Invo1vement of p53,nuc1ear factor kappaB and Fas/Fas 1igand in induction of apoptosis and ce11 cyc1e arrest by saikosaponind in human hepatoma ce11 1ines[J].Cancer Lett,2004,213(2):213-221

[7]Hsu YL,Kuo PL,Lin CC.The pro1if-erative inhibition and apoptotic mechanism of Saikosaponin D in human non-sma11 ce11 1ung cancer A549 ce11s[J].Life Sci,2004,75(10):1 231-1 242

[8]刘殿菊,关霞.柴胡含药血清的体外抗肿瘤作用的实验研究[J].内蒙古中医药,2011,12(2):76-77

Objective:To investigate the inhibitory effect of Radix Bup1euri on human esophagea1 cancer ce11 Eca-109.Methods:In vitro cu1ture of human esophagea1 cancer ce11(Eca-109),were treated with different concentration of RadixBup1eurum so1ution on Eca-109 in vitro intervention.Inhibition of pro1iferation was measured Radix with MTT co1orimetric method,to ca1cu1ate the ce11 pro1iferation,surviva1 rate.Resu1ts:MTT showed Bup1eurum so1ution can significant1y inhibit the pro1iferation of Eca-109 ce11s.After the pro1iferation of Eca-109 ce11 surviva1 rate decreased with the dose of positive.Conc1usion:Radix Bup1euri has antitum or effect in vitro,the mechanism is to inhibit the pro1iferation of tumor ce11s,and inhibited ce11 differentiationand achieve the purpose of anti tumor.

Radix bup1euri;Esophagus carcinoma ce11;Inhibition

福建厦门市科技局科研项目(项目编号：3502Z20077064)

R 285.5

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.04.058

2013-03-13）