路新利，赵宏儒，张玉琪，赵翠英，李韩平，白广义，李巧敏，陈志强，李保军，刘丽花

经血液传播是HIV效率最高的传播方式，输入被HIV污染的血液或生物制剂感染HIV的概率几乎为100%[1]。部分HIV-1感染者或患者在药物选择压力等因素的影响下体内可产生耐药毒株。本研究采用基因型检测法对经输血感染且正在进行抗病毒治疗的HIV/AIDS患者的耐药基因突变情况进行分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 河北省辖区内部分经血液感染HIV-1且病毒载量≥1000拷贝/ml的患者37例，采集其EDTA抗凝全血10ml，取50μl进行CD4细胞绝对数检测，分离血浆后进行病毒载量和耐药基因型检测。37例患者中，有偿献血者占62.2%(23/37)，受血者占37.8%(14/37)；男16例，女21例，平均年龄42.6(16～62)岁，以青壮年为主。HIV-1亚型分布为：CRF01-AE亚型2例，B亚型35例。

1.2 抗病毒治疗方案 33例采用D4T(司他夫定)/3TC(拉米夫定)/NVP(奈韦拉平)方案，占89.2%；2例采用3TC/AZT(齐多夫定)/NVP 方案，占5.4%(2/37)；2例采用3TC/TDF(替诺福韦酯)/克立芝(LPV/r)方案，占5.4%(2/37)。治疗时间平均为4.32(0.5～6)年。

1.3 CD4+T淋巴细胞和HIV载量测定 采用流式细胞仪(FACSCount，美国BD公司)和自动载量仪(COBAS AMPLlCOR，美国Roche公司)及其配套试剂盒分别测定CD4+T淋巴细胞绝对数和HIV载量，并对病毒载量测定结果取对数值。HIV-1载量仪检测范围为400.0～7.5×105拷贝/ml。

1.4 HIV-1 RNA提取和耐药基因型检测 按照参考文献[2]的方法进行。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行相关性分析。

2 结 果

2.1 CD4+T细胞数量和病毒载量结果分析 根据抗艾滋病毒治疗免疫学失败标准[3]和病毒学抑制失败标准[4]，本组患者2010年的检测数据显示，46.0%(17/37)的患者CD4+T细胞数降回到或低于治疗前水平(≤200个/μl)，免疫重建失败，67.6%(25/37)的患者不完全抑制(病毒载量≥104拷贝/ml)，病毒学抑制失败，37.8%(14/37)的患者病毒学和免疫学均失败。相关性分析结果表明CD4+T细胞数与病毒载量呈明显负相关(r=－8.165，P＜0.01)。在发生耐药性突变的20例患者中，19例患者属于免疫学失败或病毒学失败，另1例HB079患者连续3年病毒载量持续上升，CD4+T细胞数逐年下降，抗病毒治疗失效或失败(表1)。

2.2 不同治疗方案耐药结果分析 根据斯坦福大学数据库的评分标准[2]，本组患者采用的3种治疗方案中，D4T/3TC/NVP方案耐药发生率最高，达到54.6%(18/33)，其中高度耐药发生率为45.5%(15/33)。3TC/AZT/NVP方案和3TC/TDF/克立芝方案耐药发生率均为50.0%(1/2)，前者1例患者发生高度耐药，后者1例发生潜在低度耐药。发生耐药突变的20例患者均为HIV-1 B亚型毒株感染。

表1 20例发生耐药突变的患者CD4+ T细胞绝对数和病毒载量变化Tab.1 Absolute number of CD4+ T cell and virus load in 20 patients with drug resistance

2.3 蛋白酶编码区耐药基因突变 有3例患者在治疗过程中发生了蛋白酶抑制剂(PIs)位点突变，其中主要位点突变V32AV 1例，次要位点突变L10I 1例﹑A71T/V 3例，此外还有L63P﹑V77I﹑I93L等突变，但均未引发PIs耐药。

2.4 反转录酶编码区耐药基因突变 23例患者体内HIV-1发生了反转录酶基因突变，包括M184V﹑TAMs﹑Q151M复合体﹑K103N﹑Y181C等。其中核苷类反转酶抑制剂(NRTIs)位点突变V118I(1例)﹑非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)位点突变V106IV(1例)和E138A(1例)未引发任何反转录酶抑制剂(RTIs)耐药，其他20例患者体内HIV-1遗传基因突变均不同程度地导致了RTIs耐药(表2)，RTIs耐药发生率为54.1%(20/37)。在发生反转录酶突变的患者中有9例对斯坦福数据库中的11种药物全部耐药，其中4例体内的HIV-1发生了TAMs突变，2例发生了Q151M复合体突变，治疗方案均为D4T/3TC/NVP。

表2 反转录酶抑制剂相关耐药突变Tab.2 Drug resistant mutation of reverse transcriptase inhibitors

3 讨 论

河北省于1989年报告了首例HIV-1感染者，1995年从1例有偿献血者体内检测到HIV-1抗体，同时受血人群中也发现了HIV-1感染者[5]，20世纪90年代中期出现了HIV-1感染“局灶性”爆发现象。随着HIV血液筛查的实施，经输血感染HIV的概率逐年下降，但高活性抗反转录病毒疗法(HAART)可能会诱发耐药HIV-1的出现[6-7]，为防止耐药HIV-1传播，必须加强耐药性监测。

本组37例经输血感染HIV-1的患者自2003年先后接受HAART以来，有20例体内HIV-1遗传基因发生了突变，产生了耐药性，耐药发生率为54.1%(20/37)。耐药性突变主要发生于依从性差﹑CD4+T细胞数较低﹑治疗效果不好的病例[8-10]。本组发生耐药突变的20例患者中包含19例病毒学失败或免疫学失败的患者，说明基因突变是导致病毒学失败或免疫学失败的主要原因。这20例患者中有18例治疗时间在3年以上，其中HB340和HB503的治疗时间分别为半年和2年，但免疫重建和病毒抑制失败，可能与其感染耐药毒株有关(表1)。90%(18/20)的耐药患者长期使用D4T/3TC/NVP方案，抗病毒药物的应用可能诱发了HIV相应基因位点的耐药性突变[8]。此外，药物依从性﹑患者的吸收能力等也是影响抗病毒治疗效果﹑促发耐药的重要影响因素[3]。

本研究显示，20例发生耐药突变的患者中有7例未发生NRTIs突变，1例未发生NNRTIs突变，且该例患者只发生了D67DN突变导致的AZT和D4T耐药。参加3TC/AZT/NVP治疗的HB303患者和参加3TC/TDF/克立芝治疗的HB306患者都发生了单位点突变(K103N和V179D)，分别导致DLV﹑EFV﹑NVP高度耐药和DLV﹑EFV﹑ETR﹑NVP潜在低度耐药，说明合适的治疗方案能够降低病毒复制能力，减少耐药的发生。TDF﹑克立芝等二线药物治疗效果好于一线药物D4T﹑3TC﹑NVP﹑AZT，但是随着二线药物的逐渐应用，对二线药物的耐药突变也逐渐增多。

本研究还显示，蛋白酶编码区出现了主要位点突变V32AV(1例)，次要位点突变L10I(1例)﹑A71T/V(3例)和其他突变如L63P﹑V77I﹑I93L等，但这些位点突变均未引发PIs耐药。在32位点，V32AV是一个极其少见的位点突变，通常该位点突变单独出现时不会导致蛋白酶抑制剂药效降低或失效。未参加治疗的患者体内HIV-1病毒发生多态性突变A71T﹑L10I﹑A71T/V的概率为2%～3%，但在蛋白酶抑制剂的选择压力下A71T/V突变概率会升高。当A71T/V突变合并其他突变时可降低所有蛋白酶抑制剂的敏感性[11]。L10I通常会和其他突变同时出现，对大多数蛋白酶抑制剂产生耐药性，L10I在未治疗患者体内出现的概率为5%～10%。虽然这些突变本身不会直接导致耐药的发生，但可降低耐药的基因屏障[12-13]。63﹑77﹑93位点存在多态性，本身不引起耐药，但与其他蛋白酶突变并存时有助于耐药性的产生。L63P﹑I93L合并其他蛋白酶抑制剂突变时能增加蛋白酶抑制剂的耐药性，V77I与轻微降低NFV(奈非那韦)敏感性有关[11]。

本组患者中反转录酶编码区的NRTIs耐药突变主要有M184V(11例)﹑K65R(2例)﹑TAMs-1(3例)﹑TAMs-2(1例)﹑L74V(1例)﹑Q151M复合体(2例)等。M184V位点耐药突变由3TC﹑FTC选择产生，可引起这两种药物的高水平耐药，与其他突变合并出现时可中度降低ABC(阿巴卡韦)﹑DDI(去氧肌苷)的敏感性，在胸苷类似物组合中可延迟TAMs的出现，但可提高AZT﹑D4T和TDF等多种NRTIs的敏感性[14]。M184V位点突变耐药发生率为29.7%(11/37)，是本次研究中NRTIs突变位点中发生率最高的。TAMs是胸腺嘧啶类似物(D4T﹑AZT)的选择性突变，可引起全部NRTIs耐药，其中TAMs-1比TAMs-2更为常见，可引起NRTIs更高水平的耐药。

本次研究中HB072﹑HB165﹑HB289和HB319这4例患者均出现了TAMs突变和M184V突变，虽然M184V的出现可提高AZT的敏感性，但最终还是导致所有NNRTs产生了耐药性。患者HB074和HB320出现了Q151M复合体突变(A62V﹑V75I﹑Fll6Y﹑F77L和Q151M)，突变过程中首先出现Q151M，之后其他4种位点突变迅速累积，使所有NRTIs耐药性上升，造成AZT﹑DDI﹑D4T和ABC高水平耐药，TDF和3TC中度水平耐药。这两例患者同时也出现了K65R突变，该突变可引起3TC﹑DDI﹑TDF﹑FTC和ABC等中度耐药，但能够提升AZT的敏感性。发生M184V和TAMs突变的患者HB289也产生了L74V突变，导致3TC﹑ABC﹑AZT﹑D4T﹑DDI﹑FTC﹑TDF不同程度耐药。

本研究显示，Y181C和K103N是NNRTIs最常见的耐药突变，其发生频率分别为29.7%(11/37)和13.5%(5/37)，不常见的耐药突变有V108I 10.8%(4/37)﹑V179D/E 10.8%(4/37)﹑V106A 5.4%(2/37)﹑K101E 5.4%(2/37)等。K103N常由全部NNRTIs选择产生，引起DLV﹑EFV﹑NVP高水平耐药，而Y181C主要由NVP和DLV选择产生并引起这两种药物的高水平耐药和EFV低水平耐药，并可导致ETR的敏感性降低，AZT和TDF的敏感性增加。NVP选择产生的V108I﹑V106A﹑K101E和G190A突变会导致NNRTIs敏感性不同程度地降低，V108I单独存在时没有耐药性，而与其他NNRTs共存时会导致EFV耐药。患者HB167体内的HIV-1基因同时发生了V106A和F227L突变，进一步降低了NVP的敏感性。V179D/E和K103N同时存在会造成较高水平耐药，但在本次研究中并未发现。

[1] Wang LD. AIDS[M]. Beijing: Beijing Publishing Company,2009. 20-22. [王陇德. 艾滋病学[M]. 北京：北京出版集团公司北京出版社, 2009. 20-22.]

[2] Zhao HR, Lu XL, Zhao CY, et al. Analysis of drug-resistance in 36 patients treated with antivirus-therapy in Hebei province[J].Chin J Dis Control Prev, 2012, 16(5): 412-416. [赵宏儒, 路新利, 赵翠英, 等. 河北省36例抗HIV治疗患者耐药状况分析[J]. 中华疾病控制杂志, 2012, 16(5): 412-416.]

[3] Zhang FJ, Wu H, Zhao HX, et al. Handbook of national free antiretroviral treatment of AIDS[M]. 2nd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2008. 108-109. [张福杰, 吴昊, 赵红心, 等. 国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2008. 108-109. ]

[4] Brenda C, Angelina V, Arturo G, et al. Effectiveness of highly active antiretroviral therapy (HAART) among HIV- infected patients in Mexico[J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2010,26(4): 373-388．

[5] Chen SL, Zhang YQ, Zhao HR, et al. Investigation on status of HIV-1 infection among blood recipients from 1994 to 1998 in certain areas of China[J]. Chin J Epidemiology, 2009, 30(10):998-1000. [陈素良, 张玉琪, 赵宏儒, 等. 中国某地1994-1998年受血人群HIV-1 感染情况调查[J]. 中华流行病学杂志,2009, 30(10): 998-1000.]

[6] Huang L, Zhao JM, Zhao M, et al. Changes in proliferation and activation of immunocytes in gastric mucosa after HIV infection[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(4): 368-371. [黄磊, 赵景民, 赵敏, 等. HIV感染后胃黏膜内免疫细胞增生与激活的改变[J]. 解放军医学杂志, 2011, 36(4): 368-371.]

[7] Liang SY, Yu EM, Wang CJ, et al. Predictive effect of total lymphocyte count on CD4+ T lymphocyte count of HIV/AIDS patients aged 6-18 years in Henan province[J]. Zhengzhou Univ(Med Sci), 2012, 47(2): 163-166. [梁淑英, 于二曼, 王重建,等. 总淋巴细胞计数对河南省6～18岁HIV/AIDS患者CD4+T计数的预测作用[J]. 郑州大学学报(医学版), 2012, 47(2):163-166.]

[8] Li HP, Li H, Yang K, et al. Research of clincial efficacy in patients treated with antivirus drug and the untreated controls at partial region, Henan province and drug resistance[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2005, 25(3): 194-198. [李韩平, 李宏, 杨坤, 等. 河南省部分艾滋病患者抗病毒治疗的临床效果以及基因型耐药性分析[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2005, 25(3): 194-198.]

[9] Cui WG, Dou ZH, Liu J, et al. Cross-sectional study on the rate of virologic failure in HIV/AIDS patients with highly active antiretroviral therapy in three key counties of Henan[J]. Chin J Exp Clin Infect Dis (Electron Ed), 2012, 6(1): 5-9. [崔为国, 豆智慧, 刘佳, 等. 河南三个重点县HIV/AIDS抗病毒治疗者病毒学失败率横断面研究[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2012, 6(1): 5-9.]

[10] Huang L, Zhao M. Progress on the relationship between structures of lymph nodes and AIDS[J]. Med J Chin PLA, 2011,36(10): 1113-1116. [黄磊, 赵敏. 淋巴结结构与艾滋病发病关系的研究进展[J]. 解放军医学杂志, 2011, 36(10): 1113-1116.]

[11] Shao YM. The strategy and methodology for HIV drug resistance surveillance and detection[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 2010. 76-96. [邵一鸣. HIV耐药监测策略和检测技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2010. 76-96.]

[12] Wade AS, Kane CT, Diallo PA, et al. HIV-1 infection and sexually transmitted infections among men who have sex with men in Senegal[J]. AIDS, 2005, 19(18): 2133-2140.

[13] Kozal MJ, Shah N, Shen N, et al. Extensive polymorphisms observed in HIV-1-1 clade B protease gene high density oligonucleotide arrays[J]. Nat Med, 1996, 7: 753-7591.

[14] Melnick JL, Adam E, DeBakey ME. Cytomegalovirus and atherosclerosis[J]. Bioessays, 1995, 17(10): 899-903.