董 梅，王 迪，杨彩娥，孟祥红，雷 红，何菊芳，匡铁吉

解放军第309医院 检验科，北京 100091

某些结核分枝杆菌临床分离株在一定浓度的利福平作用下，不仅不会被抑制，反而生长得更快、更旺或更多，这被称为利福平依赖现象[1-3]。曾有研究表明，药物依赖现象在体外原代培养时较为突出，而传代后却不稳定，即使在含利福平的培养基上传代，其依赖性也迅速减弱，甚至完全消失。这提示，表观遗传机制在药物依赖结核菌中起着重要的作用，针对表观遗传途径的抑制剂，可能成为抗利福平依赖性结核的特效药物。我们近期研究发现，组氨酸乙酰化抑制剂丙戊酸钠(valproate acid sodium，VPA)，在培养基水平对利福平依赖现象起明显抑制作用。本研究组曾建立了稳定的利福平依赖结核病小鼠模型，为进一步研究提供了参考依据。本文旨在通过利福平依赖结核病小鼠模型，研究丙戊酸钠在体内对利福平依赖结核菌的作用，为临床抗结核提供新的思路和方法。

材料和方法

1 菌株 结核分枝杆菌利福平依赖株及耐药株分离于解放军第309医院结核病研究所病人痰标本并经多重PCR鉴定为人型结核分枝杆菌；标准菌株来自于北京结核病防治所。将原代各菌株转种，收集第三代斜面生长物备用。

2 试药和试剂 利福平胶囊购自成都锦华药业有限公司；丙戊酸钠购自湖南省湘中制药有限公司；琼脂粉、可溶性淀粉、氢氧化钠均为国产分析纯；小牛血清购自浙江金华清湖犊牛利用研究所。匡氏培养基由本室自制，具体操作详见早先报道[4]。

3 动物及分组 SPF级近交系BALB/c小鼠6~8周，体质量16~19 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCYK(京)2002-0003。将雌性小鼠分成四大组，每组32只，分别为攻毒依赖株组、耐药株组、标准株组小鼠及阴性对照组；对于每一大组，按照利福平治疗组、VPA治疗组、VPA与利福平联合治疗组、不治疗组分为四组，每组8只小鼠。将菌株分别配制成1×106CFU/ml，每只取0.2 ml小鼠尾静脉注射，对照组注入等体积的氯化钠溶液。利福平与VPA每周给药2次，剂量分别为：利福平1.3 mg/只小鼠；VPA 10 mg/只小鼠。每天观察小鼠生理状况。

4 肺组织荷菌量与依赖性测定 于第6周称重后处死全部小鼠，无菌条件下解剖，取小鼠左肺至无菌研磨器内加一定量氯化钠溶液磨至匀浆，做10倍系列稀释，各组取 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度，接种于不含药匡氏培养基和含利福平的匡氏培养基各3支斜面，36.5℃培养，每周观察依赖性，3周后进行菌落计数。

5 统计学方法 使用SAS8.1软件对肺荷菌量进行统计学处理，肺荷菌量取对数值进行变量变换，定量资料采用析因设计定量资料的方差分析。

表2 实验小鼠感染6周后肺脏荷菌量计数Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

表2 实验小鼠感染6周后肺脏荷菌量计数Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

aP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(resistant strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; cP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(dependent strains) group

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结 果

1 依赖结核菌小鼠的肺、脾脏器称重 不治疗的情况下，依赖株、耐药株及标准菌株感染组间脾、肺重量无明显差异；在利福平治疗的情况下，依赖株感染组肺、脾重量明显高于耐药株及标准株(P＜0.05)。对于依赖株，利福平治疗组肺、脾重量显著高于不治疗组(P＜0.05)，而耐药结核菌中未观察到同样现象。见表1。

2 小鼠的肺脏荷菌量 在不治疗的情况下，依赖株、耐药株及标准株感染后，组织荷菌量无明显差异；在利福平治疗的情况下，依赖株感染组菌量明显高于耐药株及标准株(P＜0.05)。对于依赖株，利福平治疗组菌量明显高于不治疗组(P＜0.05)，体现出菌株对利福平的依赖性；VPA与利福平联合治疗可有效降低肺部结核菌量(P＜0.05)，而单独VPA治疗对结核菌量并无明显改变(表2)。说明VPA可以抑制结核菌对利福平的依赖性，对于耐药结核菌及标准结核菌株，VPA并不能影响结核菌数量的改变。见表2。

表1 实验小鼠感染6周后肺、脾称重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

表1 实验小鼠感染6周后肺、脾称重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

aP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group

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讨 论

上世纪90年代初，本研究组在临床结核菌实验检测和生理学研究中发现：很多临床分离到的结核菌株，对常用抗痨药物异烟肼、链霉素和利福平等存在生理性药物依赖性，其主要特点是：在相当大的药物浓度范围内结核菌在含药环境中生长得更快、更旺和更多。这种药物依赖性在体外原代培养时尤为突出。结核菌这种药物依赖性不是遗传性的，虽然表型呈耐药性，然而相关基因不存在突变。这可能是众多耐药基因检测阴性耐药株存在的原因。我国学者钟敏等[5]、林红岩[6]等从2000年起，对利福平赖药结核菌的临床表象及生物学特征进行了较详细的研究，证明结核菌利福平赖药性客观存在，其对利福平的依赖是相对依赖，并明确利福平依赖肺结核以病情重、耐多药、化疗效果差和预后不良为主要临床特征。本课题组近期建立了稳定的依赖结核菌株感染的BALB/c小鼠模型，发现结核菌依赖性在体内可以长期存在，这使进一步研究其作用机制和治疗方法成为可能[7]。

随着分子生物学技术的发展，人们发现组蛋白去乙酰化调控作为一种重要的表观遗传修饰，通过调节组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶之间的动态平衡，参与了许多恶性肿瘤的发生发展。国际上曾有报道说：人体癌细胞药物依赖现象为表观遗传调控[7-8]，但国际上尚未见到病原菌表观遗传研究报道[9-10]。VPA近期被证实是组蛋白脱乙酰酶特异性抑制剂之一，是研究表观遗传学作用的重要探针。本研究发现，利福平治疗组依赖株感染结核菌量远大于不治疗组(6.27±0.88 vs 4.79±0.62，P＜0.05)，与先前的研究结果相符，证明依赖结核菌感染小鼠模型建立成功。利福平与VPA联合治疗组与单独的利福平治疗组相比，荷菌量大大减少(4.90±0.22 vs 6.27±0.88，P＜0.05)，说明VPA可以明显抑制结核菌对利福平的依赖性，这种抑制在体外培养和动物体内都可以观察到，说明利福平依赖性结核菌的形成机制与结核菌组蛋白乙酰化引起的表观遗传关系密切。这为研究利福平依赖结核菌的形成机制奠定了理论基础，并为临床治疗相关疾病提供了新的思路。

1 杨彩娥，董梅，匡铁吉，等．结核分枝杆菌利福平依赖株与耐受株差异蛋白的筛选与鉴定［J］ .解放军医学杂志，2009，34（9）：1124-1126，1136．

2 杨彩娥，赵利，王迪，等．结核分枝杆菌异烟肼依赖株与耐受株的耐药性调查［J］.军医进修学院学报，2011，32（5）：453-454，470．

3 吴龙章，罗春明，吴幸怡，等．广州市依赖药物结核分枝杆菌分离率的初步调研［J］.中国防痨杂志，2011，33（1）：53-56.

4 匡铁吉，宋萍，王利平，等. 分枝杆菌简化琼脂培养基的研究［J］.微生物学报，1995，35（4）：298-302.

5 Zhong M， Zhang X， Wang Y， et al. An interesting case of rifampicindependent/-enhanced multidrug-resistant tuberculosis［J］. Int J Tuberc Lung Dis， 2010， 14（1）： 40-44.

6 林红岩，杨惠玉，廖畅隆，等. 耐多药肺结核依赖利福平分支杆菌的实验观察［J］.中国防痨杂志，2003，25（z1）：46.

7 董梅，杨彩娥，雷红，等．利福平依赖结核病小鼠模型的建立［J］.军医进修学院学报，2011，32（10）：982-983，989．

8 Ross SA， Milner JA. Epigenetic modulation and cancer： effect of metabolic syndrome?［J］. Am J Clin Nutr， 2007， 86（3）：s872-s877.

9 Wilson AS， Power BE， Molloy PL. DNA hypomethylation and human diseases［J］. Biochim Biophys Acta， 2007， 1775（1）： 138-162.

10 Migheli F， Migliore L. Epigenetics of colorectal Cancer［J］. Clin Genet， 2012， 81（4）： 312-318.