王雅娟，刘进文，方向群，李天志，王俊锋，郭英华，徐国纲，常 德，苏龙翔，姜学革，刘 岩，陈振鸿，王 立，刘长庭

1解放军总医院 南楼呼吸科，北京 100853；2深圳华大基因研究院，广东深圳 518083

微生物在不同环境下会产生适应性变化，空间环境作为一种特殊的环境因素也会对微生物产生一定的影响。随着人类在太空活动的增多，航天员体内携带的细菌和飞行舱内的细菌不可避免地进入太空，这些细菌在空间环境下会产生怎样的生物学变化尤其是致病性的变化一直是航天医学关注的重点。有研究表明经航天搭载后沙门氏菌、铜绿假单胞菌的毒力均有所增加，可能对航天员的健康产生威胁[1-2]。此外有报道空间环境下细菌生物被膜的形成增多增厚，不仅可能增加细菌的毒力和耐药性，也可能腐蚀航天设备[3-4]。因此研究空间环境对细菌的影响至关重要。此外空间环境相关的低剪切力也存在于体内病原菌感染发生的环境，包括肠道、呼吸道和泌尿生殖道[5]。研究和空间环境相联系的微重力对细菌的影响有助于更好地理解细菌感染的发生。褪色沙雷菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，是水和土壤中的常居菌群，也是临床常见的条件致病菌，在空间站中也曾被检出。本研究利用神州八号飞船搭载实验平台实现了真正的空间环境这一实验条件，对返回地面的褪色沙雷菌进行蛋白质组研究，以期发现空间环境对褪色沙雷菌的影响。

材料和方法

1 材料 褪色沙雷菌购于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 1.185 7。菌株的鉴定用LA Taq酶(Takara)、PCR仪和ABI 3730xl全自动序列分析仪，蛋白浓度测定BCA试剂盒购自美国Thermo fish公司，同重同位素相对与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)试剂盒购自美国ABI公司。

2 空间环境诱导的菌株获得及鉴定 褪色沙雷菌经过神州八号飞船搭载后返回地面，搭载时间398 h，分离获得空间诱变菌株LCT-SM166，同时设地面同步温度对照株LCT-SM213。将上述两株已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABI 3730xl全自动序列分析仪测序。测序结果用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1 350 bp(双向测序)用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server 2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega 5.0软件clusterW多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1 000。

3 同重同位素相对与绝对定量(ITRAQ)技术定量蛋白质 从样品中提取蛋白，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白，用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定，等体积进行十二烷基磺酸钠电泳，酶解蛋白，用iTRAQ试剂标记肽段，将标记后的肽段进行等量混合，对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(strong cation exchange choematography，SCX)进行预分离，进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

4 蛋白质鉴定 对质谱下机的原始文件进行峰识别，得到峰列表。建立参考数据库进行肽段及蛋白质的鉴定。选择数据库遵循如下原则：若为已测序生物直接选用该物种数据库，若为非测序生物选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。本次数据库是通过比对地面对照褪色沙雷菌的基因组测序注释到的蛋白质。建立数据库后采用ProteinPilot进行蛋白质鉴定。每种样品重复了3次、绘制3次鉴定到的蛋白质重叠图，并分析肽段序列长度分布、肽段序列覆盖度和肽段数量分布。以3次重复中有2次或以上重复鉴定到的蛋白质为最终鉴定的蛋白质。

5 蛋白质定量分析 在ITRAQ定量分析中，当蛋白质定量值满足下面两个条件时视为单次重复间的差异蛋白；在3次重复中至少2次达到以下要求视为最终的差异蛋白：1)蛋白丰度差异倍数超过1.2倍以上；2)经多重假设检验，P＜0.05。

6 蛋白质及差异蛋白质的注释分析 蛋白相邻类的聚簇(cluster of orthologous groups of proteins，COG)是对蛋白质进行直系同源分类的数据库。将鉴定到的蛋白和COG数据库进行比对，预测这些蛋白可能的功能并对其做功能分类统计。GO功能显著性富集分析给出与所有鉴定到的蛋白质背景相比，差异蛋白质中显著富集的GO功能条目，从而给出差异蛋白质与哪些生物学功能显著相关。GO功能分析包括三个方面，分别为描述基因的分子功能(molecular function)、所处的细胞位置(cellular component)、参与的生物过程(biological process)。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.5倍以上，且经多重假设检验P＜0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。该分析首先把所有差异蛋白质向Gene Ontology数据库(http：//www.geneontology.org)的各个term映射，计算每个term的蛋白质数目，然后应用超几何检验，找出与所有蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著富集的GO条目。以P≤0.01为阈值，满足此条件的GO term定义为在差异蛋白质中显著富集的GO term。

结 果

1 菌株的16S rDNA鉴定 16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5 kb。LCT-SM166和LCT-SM213的16S rDNA鉴定结果为：LCT-SM166与褪色沙雷菌的匹配率为99.776%，LCT-SM213与褪色沙雷菌的匹配率为100%。说明两株菌均属于褪色沙雷菌。2 蛋白质鉴定 对空间环境诱导株LCT-SM166以及地面对照株LCT-SM213均进行了3次重复实验，其中3次重复均鉴定到的蛋白质有1 482个，两次重复鉴定到的蛋白质有231个，一共鉴定到1 713个蛋白质。肽段序列长度占总长度5%以上的肽段氨基酸残基数为7~15个，肽段序列覆盖度10%以上占80%左右(图1)，覆盖11个肽段的蛋白数量在590以上(图2)。

图1 三次重复实验的肽段序列覆盖度分布(不同颜色代表不同的序列覆盖度范围，饼状图百分比为处于不同覆盖度范围的蛋白数量占总蛋白数量的比例)Fig. 1 Distribution of peptide sequences in triplicate experiments

图2 三次重复实验的肽段数量分布图(横坐标为覆盖蛋白的肽段数量范围，纵坐标为蛋白数量)Fig. 2 Distribution of peptides in triplicate experiments

3 蛋白质定量分析 空间环境诱导株LCT-SM166经与地面对照株LCT-SM213比较后，统计得到的蛋白差异数量为111个，其中上调21个，下调90个。

4 蛋白质的COGs功能注释 80%以上鉴定到的蛋白质分布于能量的生成和转换、氨基酸的转运和代谢、碳水化合物的转运和代谢、翻译过程和核糖体的结构和生物合成、转录过程、细胞膜的合成、信号转导机制等(图3)。

图3 COG分类不同功能的蛋白质的统计数量(横坐标为COG条目，纵坐标为蛋白数量)Fig. 3 Proteins calculated according to the COG function classification

5 差异蛋白质的GO功能富集分析 空间环境诱导株LCT-SM166与地面对照株LCT-SM213的差异蛋白质所处的细胞位置主要在细菌外膜，其分子功能主要为翻译因子活性和核酸结合、苹果酸酶活性、翻译调节活性等(表1)，其参与的生物过程主要为翻译、细胞蛋白代谢过程、蛋白代谢过程、己糖代谢过程等(表2)。

表1 差异蛋白GO功能富集分析(分子功能)Tab. 1 Gene ontology enrichment analysis of proteins with differential expressions(molecular function)

讨 论

空间自然环境具有不同于地面的一些特殊因素，包括失重、高真空、极端温度、弱磁场和粒子辐射等。而航天器中产生的诱导环境则以微重力为主，是航天员生活的主要环境。空间环境对生物体影响的研究通过两种手段，一是通过航天飞船搭载或在空间站上进行的实际空间环境下的研究；二是在地面通过旋转细胞培养系统(rotary cell culture system，RCCS)、悬吊法等实施地面模拟微重力条件下的研究。既往空间环境对细菌影响的研究多集中在人类最大的常驻菌群—肠道菌群的研究。不管是航天搭载实验还是地面模拟实验均发现沙门氏菌的毒力增加，大肠杆菌在模拟微重力条件下也出现毒力增加的现象[1,6]。细菌在空间环境下发生毒力变化的机制尚不明确，通过针对沙门氏菌和铜绿假单胞菌的转录组、蛋白组分析，发现微重力可致广泛的基因转录蛋白变化，在此变化基础上发现了一种广泛的调控蛋白Hfq，在微重力所致细菌侵袭性的增加及巨噬细胞中存活能力的提高起重要的作用[1,7-8]。因此，空间环境对细菌影响和机制的研究有待进一步展开和深入。

表2 差异蛋白GO功能富集分析(生物过程)Tab. 2 Gene ontology enrichment analysis of proteins with differential expressions(biological process)

褪色沙雷菌所致院内感染可见于泌尿道、呼吸系统、伤口感染以及菌血症。该菌曾在空间站中被检出，可能威胁航天员的健康。本研究利用神州八号飞船搭载褪色沙雷菌，返回地面后采用新一代的质谱技术对空间诱变菌株进行蛋白质组学分析，鉴定出空间环境所致褪色沙雷菌的差异表达蛋白。研究发现有111个蛋白发生变化，其中上调的为21个，下调的为90个。这些蛋白主要同翻译因子活性、翻译调控因子活性、苹果酸酶活性有关，其参与的生物过程主要翻译、细胞蛋白质代谢、蛋白质代谢、碳水化合物代谢等。由此可见褪色沙雷菌在空间环境发生变化的蛋白质主要与能量的代谢有关，这可能是细菌为适应空间环境而产生的变化。

随着基因组、转录组、蛋白组等多种组学研究的发展，贯穿组学成为生物信息学研究的新方向，贯穿组学即利用生物信息学分析方法，整合基因组、转录组、表观组、蛋白质组乃至宏基因组等多层次的数据开展系统性研究。过去针对空间环境对细菌的影响的研究局限在基因组、转录组或蛋白组的单个层面，或某两个层面，本研究目前也仅涉及细菌的蛋白质组学。下一步将结合基因组、转录组，利用三维立体层面，系统地分析细菌在空间环境中的贯穿组学变化，全面筛选调控细菌在空间环境中发生改变的关键调节因子，详细解答细菌是如何感受太空环境、具体发生的变化以及如何变化等问题。

1 Wilson JW， Ott CM， Höner zu Bentrup K， et al. Space flight alters bacterial gene expression and virulence and reveals a role for global regulator Hfq［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007， 104（41）：16299-16304.

2 Crabbé A， De Boever P， Van Houdt R， et al. Use of the rotating wall vessel technology to study the effect of shear stress on growth behaviour of Pseudomonas aeruginosa PA01［J］. Environ Microbiol，2008， 10（8）：2098-2110.

3 Mclean RJ， Cassanto JM， Barnes MB， et al. Bacterial biofilm formation under microgravity conditions［J］. FEMS Microbiol Lett，2001， 195（2）： 115-119.

4 Mauclaire L， Egli M. Effect of simulated microgravity on growth and production of exopolymeric substances of Micrococcus luteus space and earth isolates［J］. FEMS Immunol Med Microbiol， 2010， 59（3）：350-356.

5 Nickerson CA， Ott CM， Wilson JW， et al. Low-shear modeled microgravity： a global environmental regulatory signal affecting bacterial gene expression， physiology， and pathogenesis［J］. J Microbiol Methods， 2003， 54（1）： 1-11.

6 Chopra V， Fadl AA， Sha J， et al. Alterations in the virulence potential of enteric pathogens and bacterial-host cell interactions under simulated microgravity conditions［J］. J Toxicol Environ Health A， 2006， 69（14）： 1345-1370.

7 Crabbé A， Schurr MJ， Monsieurs P， et al. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen［J］.Appl Environ Microbiol， 2011， 77（4）：1221-1230.

8 Dess ì A， Puddu M， Testa M， et al. Serratia marcescens infections and outbreaks in neonatal intensive care units［J］. J Chemother，2009， 21（5）： 493-499.