李云奇，肖 毅，董金凯，王 伟，田仁礼，殷小涛，林晓亮，于继云，高江平解放军总医院 泌尿外科，北京 10085；军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850；解放军第07医院 泌尿外科，北京 100071

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是肾脏恶性程度较高的肿瘤之一，也是泌尿系常见的肿瘤。过去30年中肾细胞癌的发病率逐年上升[1-3]。病人确诊时已经到了晚期，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20%~30%会发生转移，对于失去手术机会的RCC目前还没有令人满意的治疗方法[4-5]。因为它的免疫原性很高，对放化疗都不敏感，所以免疫治疗的方法作为一种新的治疗手段被给予了厚望，成为研究热点[6-8]。

本实验利用PCR技术扩增出人RCC细胞上一种膜表达抗原G250的全长基因，根据DNA重组技术将其定向插入到pIRES-neo真核表达载体中。通过脂质体转染的方法，导入renca细胞中，经过G418的加压，建立可以稳定表达人G250基因的小鼠renca细胞株，为后续肾癌疫苗的免疫应答奠定了基础。

材料和方法

1 主要材料及试剂 大肠埃希菌DH5α和小鼠renca细胞为本实验室保存，pIRES-neo真核表达载体购自Clontech公司，T4DNA连接酶，高保真PyrobestTMExTaq聚合酶是TaKaRa公司的产品，G418，PCR所用的酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，RT-PCR是toyobo公司产品，兔抗人一抗购自Santa cruz公司，FITC标记的二抗购自北京中桥技术有限公司，细胞培养用的RPMI1640来自Thermo公司，胎牛血清来自Hyclone公司，研究所用引物由Invitrogen公司合成，lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司。转染用小提试剂盒是北京天根生物技术有限公司产品，凝胶回收试剂盒，质粒回收试剂盒为北京三博远志产品。

2 人G250基因的扩增 以我们实验室前期构建的含有G250基因载体的质粒为模板，PCR扩增G250基因。……