刘志刚，吴 彦，孙青松

（1.安庆师范学院生命科学院，安徽安庆246011；2.吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室，吉林长春130062）

华支睾吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，由于其成虫寄生于人、猫、犬等动物的胆囊和胆管内，可引起胆管及其周围组织的炎症反应诱发肝硬化、原发性肝癌等严重病变［1-8］。目前，华支睾吸虫的研究主要集中在形态学、流行病学和病原鉴定等方面，对其不同发育阶段主要集中在成虫或囊蚴的研究，而对华支睾吸虫虫卵的研究甚少，虫卵的研究只限于形态学研究。本试验利用聚合酶链反应（PCR）检测人粪便中的虫卵诊断人是否患有华支睾吸虫病，为进一步探索PCR技术在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样 来自安徽省芜湖县流行区村民新鲜粪便。

1.1.2 仪器 Gene Amp PCR systerm 9700，AB公司产品；AR1140电子天平，USA奥豪斯公司产品；PY-120水平脱色摇床，北京鼎国生物技术发展中心产品；CX31RTSF生物显微镜，Olympus公司产品；NANODROP2000，Thermo公司产品；水浴锅，超净工作台，磁力搅拌器，振荡器，组织匀浆机。

1.1.3 主要试剂 20mL／L Triton X-100，KOH，蔗糖／KCl溶液，PCR 扩增 试剂，T 载体，DNA Marker，琼脂糖，DNA凝胶回收试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 粪便的收集与保存 镜检粪便发现华支睾吸虫虫卵，初步确定为阳性粪便，需要进一步鉴定。

1.2.2 虫卵DNA的提取 参考Boris Müller［9］并进行适当的改进。

将冰冻的含虫卵的粪便样品取出，于清水中融化，放入沸水中煮6min，10 000r／min离心6min，去除少量上清后，将所有液体移入2mL的EP管中，并重悬；将2mL的EP管放入沸水中煮5min，10 000r／min离心5min；去上清，计算管内样品重量，各管分别加入20mL／L Triton X-100，KOH各200μL，振荡器震荡混匀，10 000r／min离心5min，去上清，反复进行此过程，直至上清变清澈；……