曾华金，梁会丽，游 静，李世君，睢国慧，屈凌波，3*

(1.郑州大学药学院，河南郑州 450001; 2.郑州大学化学分子工程学院，河南郑州 450001;3.河南工业大学化学化工学院，河南郑州 450001)

1 引 言

复方芦丁片为卫生部药品标准收载的品种，由芦丁(Rutin，RT)和维生素 C(Ascorbic acid，AA)两味药组成，具有降低毛细管的异常通透性和脆性的作用，主要用于防治高血压病的辅助治疗。对复方芦丁片的质量标准，部颁标准是先经萃取分离，再用比色法和碘量法分别测定芦丁和维生素C的含量，方法繁杂费时[1]。近年来，随着分析技术的迅速发展，建立了同时测定复方芦丁片中这两种组分含量的分析方法，如紫外-分光光主法[2]、小波变换可见分光光度法[3]、高效液相色谱法[4-5]、近红外漫反射光谱法[6]、毛细管电泳法[7-10]等。然而，由于分析方法及药品组分本身的特点，往往存在光谱重叠、灵敏度低、样品前处理复杂、重复性较差等缺陷。因此，建立一种相对简单可靠的测定芦丁和维生素C的方法，对于复方芦丁片的质量控制具有非常重要的意义。

化学计量学是化学量测的基础理论与方法学，在处理化学量测中的实验设计、数据处理、信号解析与分辨、化学分类决策与预报等方面，解决了大量传统的化学研究方法所难以解决的复杂化学问题。其中偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)是最普遍使用的定量分析方法，该方法可有效地除去噪声，提取光谱信息，解决光谱共线问题[11]，因而能有效地解决紫外分光光度法测定复方芦丁片中两种组分时的光谱重叠问题[12]。然而，该方法的灵敏度仍然较低，不能满足药品质量检测的要求。

流动注射化学发光法由于无需检测光源、操作简单、灵敏度高、线性范围宽及仪器便宜等特点，深受分析工作者的青睐，目前已广泛应用于化学、食品、药学等领域。基于偏最小二乘法与流动注射化学发光法的优点，目前已建立了多种药品的检测的新方法[13-15]，但是针对检测复方芦丁片中芦丁与维生素C的偏最小二乘法-流动注射化学发光法却未见报道。在碱性条件下，芦丁与维生素C对鲁米诺-铁氰化钾发光体系具有明显的抑制作用，但两者峰值出现的时间存在明显差异。基于这一特点，本文将最小二乘法与流动注射化学发光法结合，建立了同时测定芦丁和维生素C的新方法。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈仪器有限公司)。

鲁米诺储备液(1 mmol·L－1)的配置:称取0.017 8 g鲁米诺(购于 Alfa aesar，USA)，用 10 mmol·L－1的氢氧化钠溶液溶解，并用 10 mol·L－1的氢氧化钠定容于100 mL棕色的容量瓶中。放入4℃冰箱，避光保存，放置3 d待其稳定后使用。

铁氰化钾储备液(10 mmol·L－1)的配置:称取0.329 g 铁氰化钾，用 0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液溶解，并用0.1 mol·L－1的氢氧化钠定容于100 mL棕色的容量瓶中，放入4℃冰箱，避光保存备用。

2.2 实验方法

按图1所示连接流动注射化学发光分析仪，分别将鲁米诺溶液、空白溶液、铁氰化钾溶液以及氢氧化钠溶液通过相应的管道输入分析系统，待基线稳定后注入样品溶液，记录反应的发光信号。将其中未加入样品的体系所产生的化学发光强度定义为本体发光值I0，而将样品加入到发光体系中所得到的化学发光强度定义为I，则降低的化学发光值ΔI=I0－I，以ΔI作为定量分析的依据。

图1 流动注射化学发光仪的流程图。Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system.

2.3 样品处理

2.3.1 复方芦丁片的处理

精密称取10片复方芦丁片并用研钵研磨成细粉，然后将细粉溶于少量 DMSO溶液中(V(DMSO)∶V(H2O)=1∶100)，随后用双蒸水定容至100 mL并过滤备用。

2.3.2 尿液的处理

于20.0 mL健康成人的尿液中加入不同量的样品溶液，然后各加入50 μL浓度为0.1 mol·L－1的NaOH溶液和1.2 mL的乙酸乙脂，振荡30 s后于12 000 r/min的转速离心1 min，将乙酸乙脂层转移至另一离心管中，在氮气保护下于室温吹干。残留物溶于适量的蒸馏水中待测。

3 结果与讨论

3.1 化学发光反应的动力学曲线

我们用IFFM-E型化学发光分析仪的静态测量系统研究了化学发光反应动力学性质。如图2所示，当芦丁和维生素C分别加入到鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系后，两种药品能明显降低该体系的化学发光强度，但两者峰值出现的时间却有所差异，分别为5.8 s和6.4 s;而当芦丁和维生素C共同加入到该化学发光体系后，其化学发光的曲线及峰值出现的时间均发生了明显的变化，峰值出现在5.6 s。这一结果表明，芦丁和维生素C与Fe3+间的反应速度存在明显差异，因而偏最小二乘法适合用于复方芦丁片中两组分的同时测定。

图2 化学发光动力学曲线。(a)4.0 μmol·L－1鲁米诺溶液 +4 mmol·L－1铁氰化钾溶液;(b)4.0 μmol·L－1鲁米诺溶液 +4 μmol·L－1铁氰化钾溶液 +0.06 mg·L－1芦丁;(c)4.0 mmol·L－1鲁米诺溶液 +4 mmol·L－1铁氰化钾溶液 +0.4 mg·L－1维生素 C;(d)4.0 μmol·L－1鲁米诺溶液 +4 mmol·L－1铁氰化钾溶液 +0.4 mg·L－1维生素 C+0.06 mg·L－1芦丁。Fig.2 CL signals for(a)4.0 μmol·L －1luminol+4 mmol·L －1K3Fe(CN)6，(b)4.0 μmol·L －1luminol+4 mmol·L－1K3Fe(CN)6+0.06 mg·L－1of RT，(c)4.0 μmol·L－1luminol+4 mmol·L－1K3Fe(CN)6+0.4 mg·L－1 AA，and(d)4.0 μmol·L－1luminol+4 mmol·L－1 K3Fe(CN)6+0.4 mg·L－1AA+0.06 mg·L－1RT.

表1 同时测定芦丁和维生素C的最佳条件Table 1 The optimum conditions for simultaneous determination of AA and RT

3.2 实验条件的优化

为了获得最佳的检测灵敏度和最适合的信噪比，对实验流速、反应介质及各反应溶液的最适浓度进行了考察，结果如表1所示，表明当主泵和副泵流速均为 3.5 mL·min－1、反应介质为 0.10 mol·L－1NaOH 溶液、鲁米诺浓度为 4.0 μmol·L－1、铁氰化钾浓度为 4 mmol·L－1时，能获得最佳的灵敏度，因而选定这些浓度作为测量的最佳浓度。

3.3 干扰实验

在上述优化的实验条件下，为了验证在实际检测应用中的可行性，以芦丁质量浓度为0.10 mg·L－1，维生素 C 质量浓度为 1.00 mg·L－1作为标准，对药品中可能存在辅料、阴阳离子及其它药物进行了考察，以相对误差不大于±5%计算。结果表明:150倍的，200倍的 Glucose、Sucrose和 EDTA，80倍 Ca2+和 Ba2+，50倍的 Dextrin和 Urea，30倍的 Starch、Mg2+和DMSO 溶液 (V(DMSO)∶V(H2O)=1∶100)均不干扰测定。但Cu2+、dopamine和amoxicillin对实验的干扰较大。

3.4 单组分线性关系考察

在优化条件下，对芦丁和维生素C分别进行了测定，结果表明，发光强度ΔI与芦丁浓度和维生素C 浓度(c)在0.02 ～0.6 mg·L－1和0.1 ～20 mg·L－1范围内呈线性关系，其线性方程分别为ΔI=12660c+32.018(R2=0.999 8)和 ΔI=2098.7 c+88.12(R2=0.997 7)。根据 IUPAC 建议，计算本方法的检测限芦丁和维生素C分别为4.5 μg·L－1和8.9 μg·L－1(信噪比为3)。对质量浓度为0.1 mg·L－1的芦丁和 1.0 mg·L－1的维生素 C溶液平行测定10次，得方法的相对偏差分别为2.80%和 1.42%。

3.5 PLS模型的建立

3.5.1 校正集的建立

采用正交实验方法，选择L25(52)正交表设计校正集，选取芦丁和维生素C的各5个浓度水平分别为 0.02，0.05，0.1，0.3，0.6 mg·L－1和 0.1，0.5，2.0，8.0，16.0 mg·L－1，共配制 25 组溶液，进行分析测定。

3.5.2 主因子数的选择

在PLS法中，主因子数会受到体系中被测物质的交互作用和基体效应以及噪声的影响，故一般选用交互验证法得到的预测残差平方和(PRESS)来确定主因子数[13]，得到噪声最小的最佳主因子数。

根据F检验，本体系的PRESS计算结果表明，最佳主因子数均为3时，PRESS达到极小值。

3.5.3 模型预测结果的准确性与精密度考察

分别配制6组模拟样品，其加入浓度组成及测定结果见表2。

将测得的值与建立的校正集结合，用PLS模型计算含量，以浓度计算值与浓度真实值进行回归分析，线性方程分别为 YRT=1.011XRT－0.0215(R2=0.999 8) 和 YAA=1.0434 XAA－ 0.0097(R2=0.994 5)。模型其它统计参数:均方根误差(Root mean square difference，RMSD)、相关系数(Square of the correlation coefficient，R2)及预测的相对误差(Relative error of prediction，REP)可按下列公式[13]进行计算。

表2 芦丁和维生素C混合样品的预测结果Table 2 Prediction results for the synthetic mixture of AA and RT

其中ci表示样品的真实浓度i表示样品的估计浓度i表示样品真实浓度的平均值，n是样品的总数。计算结果见表3，可见PLS模型具有良好的预测性能。

表3 PLS校正模型的统计参数Table 3 Statistical parameter of the optimization matrix using the PLS model

3.6 实际样品分析

按2.3.1方法进行样品处理，将所得的样品溶液用所建立的PLS模型处理，测定结果见表4。结果表明，用PLS模型测定复方芦丁片中芦丁与维生素C的含量与其标示量十分吻合(复方芦丁片中芦丁标示量为每片50 mg，维生素C的标示量为每片20 mg)。

此外，该PLS模型也应用于人体尿液中芦丁和维生素C含量的测定。由表5可看出，尿液中样品回收率为96.3% ～104.0%，其相对标准偏差为0.68% ～1.67%。与现有同时测定芦丁和维生素C的分析方法比(表6)，该方法具有灵敏度高，分析速度快及操作简单等优点，适合用于药品及生物样品等复杂体系中芦丁与维生素的同时测定。

表4 复方芦丁片中芦丁和维生素C的测定结果Table 4 Determination of AA and RT in compound rutin Tablets

表5 人体尿液中芦丁和维生素C的测定结果Table 5 Determination of AA and RT in human urine samples

表6 同时测定芦丁和维生素C的分析方法的比较Table 6 Analytical methods for simultaneous determination of AA and RT

4 结 论

根据芦丁和维生素C均对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系具有显著的抑制作用，但两者峰值出现的时间存在明显差异这一特点，将偏最小二乘法与流动注射化学发光法结合，建立了同时检测复方芦丁片和人体尿液中芦丁与维生素C的新方法。该方法具有灵敏度高、分析速度快及操作简便等优点，为药品及生物复杂体系中芦丁与维生素C的同时测定提供了可靠的实验方法。

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