江 海，李新生,*，吴三桥，张志健，刘 新，韩 豪，高 玥，彭 浩，胥彦明

(1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；3.陕西城固酒业有限公司，陕西 城固 723200)

柑橘是世界第一大水果，世界柑橘常年总产量6000～10000万t。分布于全球140个国家和地区，其中柑橘产量居世界前3位的分别为巴西、美国、中国[1-3]。我国柑橘经济栽培区主要集中在北纬20～33°之间，海拔700～1000m以下的亚热带、热带地区，年栽培面积133～200万公顷之间，占世界栽培面积的20%，其中长江上中游柑橘带、赣南-湘南-桂北柑橘带、浙南-闽西-粤东柑橘带为我国柑橘优势栽培区[4]。2007年，我国柑橘种值面积和产量均居世界首位[5]，主要包括日南1号、宫川、山下红、大浦、兴津等100多个品中。其中宽皮橘类占80%以上，多集中于11—12月上市。世界柑橘加工率约为40%，主要加工产品年产量大约为1860×104t，分别为柑橘汁、橘瓣罐头，以及柑橘糖制品果酱、果冻和蜜饯[6-7]。而我国柑橘的加工率不足10%，鲜食量超过90%。

随着柑橘栽培面积的扩大，加之品种结构不合理，柑橘上市集中，国内缺乏大型柑橘加工企业等原因，目前国内柑橘产业常常出现“丰产不丰收”，柑橘滞销，橘农“卖橘难”等问题，严重挫伤了橘农种植积极性，在个别地方甚至出现了橘农砍伐果树的现象。解决我国柑橘滞销问题，最可行的办法就是大力发展柑橘深加工。

鉴于此，本项目组开展了利用柑橘果汁发酵生产柑橘果酒的生产技术研究，但是，在柑橘果酒发酵过程中，橘子汁发酵液会出现极明显的苦味，这成为了困扰柑橘果酒生产的难题。柑橘发酵中苦味主要来自柠檬苦素类(limonins)的作用。柠檬苦素是一种三萜类的植物次生代谢产物，广泛存在于柑橘属植物中，至今已从柑橘属植物中分离出36种柠檬苦素类似物及17种柠檬苦素类似物配糖体[8-9]。据报道，柠檬苦素在水溶液中的苦味阈值约为1×10-6mol/L。有强烈苦味的柠檬苦素和诺米林酸，如果在柑橘果汁中的含量超过6mg/L，那么这种柑橘就不适合用于饮食业[10-13]。

本实验利用超高效液相色谱-质谱(ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)对柑橘果酒发酵工艺中橘汁发酵液柠檬苦素进行跟踪监测，分析橘子发酵加工产品中苦味变化趋势，旨为柑橘果酒研制提供基础实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

汉中主产柑橘品种宫川，经剥皮、榨汁、橘汁调节糖度后于发酵罐中发酵，取不同发酵阶段和陈酿阶段的液体为检测材料[14-15]。

乙腈(色谱纯) 美国Burdick and Jackson 公司；娃哈哈纯净水；甲醇(分析纯) 天津市登峰化学试剂厂；柠檬苦素(纯度为99.8%) 天津一方科技有限公司。

1.2 材料与仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱、ACQUITY TQD三重四极杆质谱仪 美国Waters公司；水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；TD24-低速台式离心机 长沙湘仪器有限公司；AUW220D电子天平(十万分之一)、AUY220电子天平(万分之一) 日本岛津公司；SK1200H超声波清洗机 无锡市兴邦基业电子有限公司；BM252C榨汁机 美的公司；全自动生物发酵罐(7L) 上海保兴生物设备工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50mm×2.5mm，1.9μm)，柱温40℃，流速0.3mL/min，进样5μL。流动相为：乙腈-水(A：B)梯度洗脱，乙腈(A)梯度为0～3min(10%～50%)，3～4min(50%～10%)，4～5min(10%～10%)。

1.3.2 质谱条件

毛细管电压3.2kV，锥孔电压40kV，离子源温度110℃，脱溶剂气温度400℃，锥孔气流量50L/h，脱溶剂气流量800L/h。离子化模式为电喷雾离子源正离子模式(electrospray ionization，ESI+)，碰撞池电压30V，碰撞氩气流速0.14mL/min。采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，柠檬苦素母离子m/z 471.1，子离子m/z 425.3、161.1。

1.3.3 标准品溶液的制备

用AUW220D电子天平，精密称取柠檬苦素标准品2.85mg，用10mL乙腈溶解，超纯水定容至25.0mL。制得柠檬苦素114mg/L的标准对照母液。

1.3.4 标准曲线制备

取柠檬苦素标准母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mL，用50%乙腈溶液定容于10mL容量瓶。得到含柠檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的标准工作溶液。在仪器设定的色谱-质谱条件下，通过0.22μm滤膜过滤，进标准梯度样品各5μL，以柠檬苦素母离子m/z 471.1进行选择，m/z 425.3为定性离子，m/z 161.1为定量离子。

1.3.5 定量限实验

将含柠檬苦素0.57μg/mL的标准溶液逐级稀释，在液相质谱分析条件下进样分析，以RSN=10确定柠檬苦素和诺米林检测的定量限。

1.3.6 样品的制备

取3批橘子汁样品各5L(总糖70.9g/L，总酸9.26g/L)做平行实验，调节总糖质量浓度到218g/L，引入葡萄酒酵母，21℃条件下在发酵罐中主发酵7d，主发酵结束后酒精度(V/V)为12.5%～13.5%(20℃)，后导入陶罐中进行陈酿。

取主发酵时间为0、2、4、5、6、7d的发酵液和陈酿15、30、60、90、180d和360d的基酒进行分析检测。

精密量取5.0mL橘汁发酵液于50.0mL具塞三角烧瓶中，加5.0mL乙腈，称定烧瓶质量。超声处理30min，称量烧瓶质量，用乙腈补足损失质量。4000r/min离心3min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 柠檬苦素线性的绘制

图 1 柠檬苦素标准品色谱-质谱图Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin standard

标样色谱图见图1，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标拟合标准工作曲线。柠檬苦素线性回归方程为：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。该检测条件下，柠檬苦素在2.85～114ng之间线性关系良好。

2.2 定量限确定

经实验，在液相-质谱分析条件下进样分析得到RSN=10，计算得柠檬苦素的定量检测限为2.8ng/mL。

2.3 重复性实验

取同一橘汁发酵液，按1.3.6节方法制备样品，在色谱-质谱条件下平行测定5次，每次进样5μL，测定柠檬苦素的峰面积，计算相对标准偏差。其中柠檬苦素的峰面积分别为432.1、448.2、428.5、439.8、437.6，RSD为1.73%(n=5)，结果表明方法的重复性良好。

2.4 稳定性实验

取同一橘汁发酵液，在色谱-质谱条件下，分别在0.5、1、6、12、24h进样5μL检测柠檬苦素的峰面积，分别为428.7、432.2、425.6、411.8、410.6，计算相对标准偏差，求得RSD为2.36%(n=5)。结果表明在该方法条件下，柠檬苦素24h内稳定。

2.5 回收率实验

精密量取已测定柠檬苦素为12.46mg/L的橘汁发酵液5.0mL，加入5.7mg柠檬苦素标准物质，按1.3.6节方法制备样品条件平行制备3份，在色谱-质谱条件下测定，计算柠檬苦素的回收率，结果如表1所示。

表 1 回收率测定结果Table 1 Recovery rate of the UPLC- MS/MS method

2.6 橘子汁发酵液中柠檬苦素含量

表 2 橘汁发酵液中柠檬苦素的质量浓度Table 2 Limonin concentration in fermented orange juice

图 2 橘汁发酵液柠檬苦素色谱-质谱图Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin in fermented orange juice

橘汁发酵4d后液体中的柠檬苦素的色谱图见图2，平行制备3个批次的橘子汁发酵液，按1.3.6节方法进行样品制备，在设定的仪器条件下进行检测。橘汁中的柠檬苦素的含量分析结果见表2。

图 3 第1(A)、2(B)、3(C)批橘汁样品中柠檬苦素变化趋势图Fig.3 Changes of limonin in batch 1 (A), 2 (B) and 3 (C) of fermented orange juice

由表2显示，橘汁在发酵过程中柠檬苦素有一个上升的过程，基本在主发酵结束时达到最高值，随着陈酿时间的延长，柠檬苦素含量逐渐降低。柠檬苦素的变化趋势如图3所示。

3 讨论与结论

3.1 柠檬苦素含量的测定可用于控制柑橘及其相关产品的质量。已报道的检测方法很多, 主要有Davis法、分光光度法、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)等[8,16-18]。由于柠檬苦素类似物配糖体极性强，在提取液中常与许多杂质共存，因而对其检测及纯化都很困难，多数检测方法效果不佳。对于柑橘及其加工产品中低含量的柠檬苦素没有办法进行精确定量。本实验采用的UPLC-MS/MS分析方法能够准确的定量分析柑橘产品中的柠檬苦素，检测限低、样品处理简单、重复性好，能够用于柑橘及其相关产品中柠檬苦素含量的分析，控制相关产品质量。

3.2 通常柑橘鲜食无苦味，但经榨汁、杀菌等加工处理后就表现出苦味。从实验结果可以看出，柑橘发酵液有一个明显的柠檬苦素上升的过程，该现象印证了橘汁产品的“延迟苦味”。据研究，柑橘汁出现“延迟苦味”的原因主要是在酸性条件和柠檬苦素D环内酯水解酶的催化下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素A-环内酯转变成了具有强烈苦味的柠碱[19]。

柑橘加工产品出现延迟苦味是柑橘加工业中比较重要的问题，避免苦味的产生或脱除橘汁中的苦味物质是提高柑橘加工产品品质的关键。现常见的脱苦技术有吸附法、固化霉脱苦法、生物法、β-环糊精脱苦法、分离法脱苦等[20-21]。在实验过程中，曾采用自然沉降法，检测苦味物质的变化。苦味物质随时间从低到高再逐渐降低，也能达到脱苦的效果，不过耗时较长，但对于发酵生产橘子果酒，长时间的保存发酵液能增加产品的厚重感和产品特有风味。

3.3 发酵过程中发酵条件的控制也是橘汁发酵液产生苦味的一个重要原因。但无论如何控制条件，橘子汁发酵液中的柠檬苦素都有一个逐渐上升再到慢慢降低的过程，橘汁发酵液中柠檬苦素的这种变化趋势，将指导橘子酒的生产。取不同发酵时间的发酵液勾兑得到橘子果酒，发酵时间短的橘子果酒，苦涩味明显，消费者多不接受。360d(一年)后的发酵液勾兑的产品香味纯正，具橘子特有清香、酒体橙黄、澄清透明、酸甜柔和、无明显苦涩感，能为多数消费者接受。采用发酵保藏时间一年以上的橘汁发酵液生产橘子果酒，能获得品质较高的橘子酒。

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