王月晖，徐洪宇，张京芳*，侯力璇，成 冰

(西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100)

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一种含铜氧化酶，是引起果蔬酶褐变的主要酶类[1-2]。PPO催化氧化多酚类物质变成醌，醌再经过非酶促聚合形成褐色物质，从而导致果蔬产品感官品质劣变，并降低了其营养价值[3]。

林向东等[4]认为葡萄干感官质量下降的主要原因是由于葡萄中PPO催化氧化多酚类。目前已有葡萄PPO特性的研究报道[5-7]。Dry[8]、Virador[9]等分析了葡萄PPO晶体结构及序列。Zheng等[10]分离纯化了无核白葡萄的PPO，并研究了其生化特性，为控制葡萄制品褐变提供了依据。Rapeanu等[11]研究了Victoria葡萄PPO的活性及其抑制剂。Wissemann等[12]发现白葡萄PPO活力在整个成熟期内呈现波动状态，在酿酒过程中鲜葡萄破碎时PPO活力最大，皮渣分离时PPO活力终止。不同品种酿酒红葡萄PPO活力尚未见研究报道。

酶促褐变的底物多酚类具有较强的抗氧化活性及抑菌、抑肿瘤、抗衰老和抗心血管疾病的作用[13-14]。总酚(total phenol，TP)含量是评价果蔬产品及葡萄酒抗氧化活性的重要指标之一[15]。作为葡萄的重要次生代谢产物，酚类物质与葡萄的抗病性、采后生理、保鲜、贮存以及与葡萄汁(酒)的色泽、风味等品质指标密切相关[16]。酚类物质主要参与形成葡萄酒的味道、骨架、结构和颜色等，尤其对红葡萄酒的特征和质量有重要影响[17]。在葡萄酒的生产过程中，20%的酚类物质因为与空气接触造成氧化而损失[18]。含有较高PPO活力的葡萄品种，在同等条件下，其酚类物质损失更多，因此选择PPO活力低的葡萄品种有助于保护葡萄酒的营养价值及感官质量。

本实验测定27种酿酒红葡萄品种的PPO活力、TP和褐变度(browning degree，BD)，分析了其与干红葡萄酒L*值之间的相关性，旨在阐明酿酒红葡萄PPO活力及TP对干红葡萄酒感官品质的影响，并根据PPO活力和TP的不同，对葡萄品种进行分类，为酿制优质干红葡萄酒的原料选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

27个酿酒红葡萄品种(分别是巴柯、宝石解百纳、赤霞珠、法国兰、盖吾莎、赫尔松、黑彼诺、黑后、黑赛比尔、黑赛林、红艾基、红星吉里、吉姆莎、佳丽酿、佳美、捷莱乌苏姆、卡马特、克里木波西、马夫鲁特、玫瑰香、梅鹿辄、品丽珠、蛇龙珠、塔夫里斯、塔乌西、维比林、依达)，于2010年9月下旬至10月中旬手工采摘于新疆玛纳斯县中信国安葡萄酒厂葡萄品种资源圃。资源圃生态条件：地处东经86°13’，北纬47°17’，海拔470m，1998年定植，南北行向，株行距1.5m×2.0m，多主蔓扇形，冬季埋土，采用正常的生产园管理。

采收期确定：从已标记的10株植株果穗上(自转色期开始)每7d从不同方位分别随机选取100个果粒，测其可溶性固形物含量(手持式折光仪)和可滴定酸(NaOH中和滴定法)，待可溶性固形物含量达到14%后，每隔3d取一次样，绘制固酸比曲线进行成熟度控制，当曲线达到最大并稳定后作为葡萄果实的最佳采收期。

采收方法：在葡萄架的上、中、下3个部位分别选取有代表性的葡萄果穗进行均匀采样，采样后立即放入保鲜袋，运至实验室，待葡萄样品散尽田间热并达到室温后，置于－40℃保存。

Folin-Ciocalteu试剂、Triton X-114 美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、三氯乙酸、没食子酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RE-52A旋转薄膜蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；UV-752紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；ALPHA 1-2 LD plus 冷冻干燥机 上海旦鼎国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄浆果预处理

参照Orak等[19]方法，稍作修改。将葡萄颗粒去籽后，加入液氮研磨成匀浆，称取4.000g葡萄匀浆，加入0.1%盐酸酸化甲醇40mL，超声波室温提取20min/次，至提取液无色(约5～6次)，合并提取液，用旋转薄膜蒸发仪于35℃条件下浓缩至10～20mL，然后用0.1%盐酸酸化甲醇定容至25mL，存放于－40℃备用。

1.3.2 葡萄浆果TP含量的测定

参照Slinkard等[20]的方法，并略做改动。取0.15mL适当稀释后的提取液，加入Folin-Ciocalteu试剂(稀释10倍)1.5mL，混匀，静置5min后，加入1.5mL 60mg/L碳酸钠溶液，混匀后于75℃恒温水浴中反应2h，于760nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。根据标准曲线计算葡萄浆果TP含量，TP含量以每克葡萄匀浆中含有没食子酸毫克数计，单位为mg/g。

1.3.3 葡萄浆果PPO活性测定

参 考N ú ñ e z-D e l i c a d o 等[21]方 法。取 葡 萄 匀 浆(1.0±0.001)g，加入5mL 100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.3)，快速搅拌后，用纱布过滤，于4℃条件下离心(4000×g，15min)，弃掉上清液，再将沉淀悬浮在4mL 100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.3，含4% Triton X-114)中，于4℃条件下保持15min，然后升温至37℃继续保持15min。此时，该混合物分层，形成的胶体沉淀中含有酚类和花色苷等成分，将分层后的溶液于25℃条件下离心(10000×g，15min)，取上清液作为酶源，保存于－20℃备用。

PPO活力测定：取3.0mL 10mmol/L儿茶酚 (10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH5.0)与50μL粗酶液，于25℃条件下反应10min，于400nm波长处测定吸光度在10min内的变化。以每分钟吸光度变化0.001的酶量计为一个酶活力单位(U)。

1.3.4 葡萄浆果BD的测定

取0.2mL葡萄浆果的酸化甲醇提取液，冷冻干燥，加入3mL 10mmol/L McIlvaine缓冲溶液(pH5.0)及750μL PPO提取液，混匀，于25℃条件下反应10min，于400nm波长处测定吸光度A1，BD以10×ΔA400nm表示。

式中：A0为褐变反应前的吸光度；A1为反应10min后的吸光度。

1.3.5 干红葡萄酒酿造工艺

采用西北农林科技大学葡萄酒学院“干红葡萄酒小容器酿造法”[22]酿造27种不同品种干红葡萄酒。

1.3.6 干红葡萄酒色值的测定

运用透射量法，D65日光光源，测定L*、a*、b*值。L*为亮度，a*为红度(－a*绿度)，b*为黄度(－b*蓝度)。

1.3.7 统计分析

运用SPSS 18.0进行数据分析，每个实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 27个酿酒红葡萄品种的总糖、总酸含量及pH值

表 1 27个酿酒红葡萄品种的总糖、总酸含量及pH值(±s，n=3)Table 1 Total soluble solid content, titrate-acid and the pH value of 27 red wine grape cultivars (±s，n=3)

表 1 27个酿酒红葡萄品种的总糖、总酸含量及pH值(±s，n=3)Table 1 Total soluble solid content, titrate-acid and the pH value of 27 red wine grape cultivars (±s，n=3)

注：同列字母不同表示差异性显著(P＜0.05)。表2 同。

序号 葡萄品种 总糖含量/(g/L)总酸含量/(g/L)pH 1巴柯(Bacol noir)208.2±2.2hi5.86±0.06j3.56±0.02fi 2 宝石解百纳(Ruby Cabernet)205.0±2.1ei5.19±0.01l3.95±0.05a 3 赤霞珠(Cabernet Sauvignon)256.2±4.2k7.16±0.08d3.91±0.07ab 4法国兰(Blue French)189.7±2.2cd7.11±0.04de3.29±0.05klm 5盖吾莎(Чeнyca Чибил)209.7±3.8hi6.65±0.05hi3.64±0.03efg 6赫尔松(Херсонесский)244.4±0.6k9.31±0.04a3.29±0.03lm 7黑彼诺(Pinot noir)209.9±2.3hi8.14±0.04c3.18±0.03m 8黑后(Heihou)198.8±3.6di6.47±0.04i2.92±0.03n 9黑赛比尔(Seibel noir)193.7±5.8dg5.88±0.02j3.74±0.04cde 10黑赛林(Cepин Чepный)167.2±2.6b6.67±0.03h3.65±0.01efg 11红艾基(Эким Κара)209.6±2.5hi5.50±0.07k3.53±0.03ghi 12红星吉里(Чингpи Kapa)247.7±4.5k8.54±0.01b3.43±0.03hij 13吉姆莎(Kadarka)197.9±1.1dh4.34±0.02o3.86±0.02abc 14佳丽酿(Carignan)191.5±1.5cde5.40±0.02k3.39±0.05jkl 15佳美(Gamay)179.1±1.5bc8.57±0.06b3.19±0.01m 16捷莱乌苏姆(Дере Узюм)204.0±7.5ei4.92±0.03m3.30±0.03jm 17卡马特(Kapц Maт)212.7±3.4ij8.66±0.07b3.43±0.03ijk 18 克里木波西(Κ рымпошие)226.0±6.8j8.03±0.04c3.27±0.03lm 19马夫鲁特(Мавруд)205.8±1.0fi 6.81±0.05fh3.57±0.05fgh 20玫瑰香(Muscat Hamburg)193.2±2.0def5.17±0.03l3.81±0.06bcd 21梅鹿辄(Merlot)205.8±2.0fi 6.78±0.04gh3.56±0.06fi 22品丽珠(Cabernet Franc)224.1±5.9j5.97±0.08j3.65±0.03efg 23 蛇龙珠(Cabernet Gernischet)207.7±5.1ghi6.91±0.07fg3.39±0.02jkl 24塔夫里斯(Taвpиц)201.8±4.6di7.27±0.02d3.61±0.02efg 25塔乌西(Tayщ)150.3±0.7a8.53±0.05b3.38±0.02jkl 26维比林(Вэй Билин)173.4±2.4b4.58±0.03n3.68±0.03def 27依达(ИДa)196.7±0.6dh6.97±0.05ef3.37±0.04jkl平均值204.076.1783.502

由表1可知，同一产地及相同年份27种酿酒红葡萄品种总糖、总酸含量及pH值之间存在显著性差异(P＜0.05)。由于气候等因子对酿酒葡萄成熟度的影响，造成同一产地不同年份的葡萄糖、总酸含量及pH值发生变化[23]，以赤霞珠为例，新疆玛纳斯地区2005年[24]和2008年[25]最佳采收期时总糖含量分别为210.3g/L和249.7g/L、总酸含量为7.9g/L和5.97g/L、pH值为3.64和3.67；这与本研究测定的2010年玛纳斯地区的赤霞珠葡萄，其总糖含量256.2g/L、总酸含量7.16g/L及pH3.91，均存在差异。不同产地同一品种葡萄总糖、总酸及pH值亦不相同[26]。

2.2 27个酿酒红葡萄品种PPO活力、TP含量及BD

由表2可知，不同酿酒红葡萄品种的PPO活力、TP含量及BD存在显著性差异(P＜0.05)。酿酒红葡萄品种PPO活力平均值为23.83U/mL，以黑后的PPO活力最大(50.43U/mL)，其次是佳丽酿和赫尔松(分别为41.58、36.77U/mL)，黑赛林的最小(10.43U/mL)。27个酿酒红葡萄品种的TP含量范围(1.04～5.15mg/g)，Yi等[27]报道的7个酿酒红葡萄品种TP含量范围(1.4～3.1mg/g)，本实验测定酿酒红葡萄品种的TP含量范围更宽，原因是所用品种及栽培条件不同。27个酿酒红葡萄品种中以黑赛比尔的TP最高，蛇龙珠次之，红艾基最低，分别为5.15、5.08、1.04mg/g。黑后的BD最大(8.22)，巴柯次之(7.32)，而法国兰BD最小(0.46)。由此可见，本研究选取的27个酿酒红葡萄品种中，黑后的PPO活力及BD最大，而黑赛比尔和蛇龙珠的TP较高且PPO活力较低。

表 2 27个酿酒红葡萄品种的PPO活力、TP含量、BD及η值(±s，n=3)Table 2 PPO activity, total phenolic content, browning degree and the value of η of 27 red wine grape cultivars (±s，n=3)

表 2 27个酿酒红葡萄品种的PPO活力、TP含量、BD及η值(±s，n=3)Table 2 PPO activity, total phenolic content, browning degree and the value of η of 27 red wine grape cultivars (±s，n=3)

序号 葡萄样品PPO活力/(U/mL) TP含量/(mg/g)BDη(PPO活力/TP含量)1巴柯(Bacol noir)33.75±0.08d4.04±0.03c 7.32±0.04b8.36 2 宝石解百纳(Ruby Cabernet)30.90±0.31e4.60±0.06b 5.15±0.05d6.72 3 赤霞珠(Cabernet Sauvignon)19.30±0.35jk3.71±0.01d 1.73±0.03j5.21 4法国兰(Blue French)15.53±0.41mno1.83±0.01jk 0.46±0.00q8.49 5盖吾莎(Чeнyca Чибил)31.54±0.63e3.01±0.07e 0.92±0.02lm10.47 6赫尔松(Херсонесский)36.77±0.66c1.82±0.02jk 0.76±0.05no20.15 7黑彼诺(Pinot noir)25.59±0.39g1.58±0.01kl 2.93±0.07g16.24 8黑后(Heihou)50.43±0.36a2.61±0.07fgh 8.22±0.02a19.35 9黑赛比尔(Seibel noir)16.87±0.51lmn5.15±0.13a 2.78±0.01hi3.28 10黑赛林(Cepин Чepный)10.43±0.84q1.62±0.03kl 2.94±0.04g6.43 11红艾基(Эким Κара)14.26±0.17op1.04±0.01n 0.60±0.04pq13.73 12红星吉里(Чингpи Kapa)21.08±0.69ij2.06±0.03ij 0.87±0.01mn10.22 13吉姆莎(Kadarka)28.08±0.96f2.46±0.04h 0.66±0.02op11.41 14佳丽酿(Carignan)41.58±0.07b2.51±0.07gh 6.25±0.04c16.59 15佳美(Gamay)25.74±0.07g2.04±0.02ij 1.02±0.07l12.65 16捷莱乌苏姆(Дере Узюм)13.65±0.63op1.92±0.02ij 3.48±0.00f7.12 17卡马特(Kapц Maт)17.17±0.08lm2.62±0.05fgh 0.84±0.00mn6.55 18 克里木波西(Κ рымпошие)27.08±0.21fg1.26±0.05mn 1.05±0.05l21.45 19马夫鲁特(Мавруд)30.41±0.08e2.98±0.13e 1.40±0.06k10.20 20玫瑰香(Muscat Hamburg)12.44±0.43o2.17±0.10i 0.59±0.00pq5.74 21梅鹿辄(Merlot)18.12±0.48kl2.77±0.08efg 1.29±0.01k6.55 22品丽珠(Cabernet Franc)21.82±0.08hi2.81±0.11ef 2.64±0.07i7.76 23 蛇龙珠(Cabernet Gernischet) 16.41±0.24lmn5.08±0.20a 2.86±0.02gh9.46 24塔夫里斯(Taвpиц)15.07±0.80no1.50±0.04lm 0.94±0.00lm3.23 25塔乌西(Tayщ)14.28±0.10op1.97±0.09ij 0.96±0.01lm10.07 26维比林(Вэй Билин)32.03±0.27de1.26±0.02mn 0.54±0.03pq7.26 27依达(ИДa)23.03±1.01h1.52±0.02lm 3.79±0.06e25.49 平均值23.832.522.3315.14

2.3 酿酒红葡萄PPO活力、TP含量、BD及葡萄酒色值相关性分析

由表3可知，酿酒红葡萄中PPO活力与TP含量之间无显著相关性(P＞0.05)，这与Wissemann等[12]的报道一致。BD与PPO活力、TP含量之间存在极显著正相关(P＜0.01)，相关系数分别为0.548和0.376，说明PPO活力及TP含量含量对酿酒葡萄的褐变有至关重要的影响，且PPO活力对BD的贡献大于TP含量。因此，酿酒葡萄PPO活力愈强，其愈容易褐变。

葡萄酒色泽是影响葡萄酒感官质量的重要指标之一[28]。由表3Pearson相关分析可知，酿酒红葡萄的PPO活力、TP含量及BD分别与干红葡萄酒L*值呈显著或极显著负相关，其相关系数由大至小，分别为TP含量(0.754)＞BD(0.569)＞PPO活力(0.441)，表明三者对葡萄酒L*值有显著影响。PPO活力愈强，酚性成分氧化褐变愈严重，从而影响干红葡萄酒的感官品质及营养价值。因此，有必要选择PPO活力低且TP含量高的酿酒葡萄品种，从原料上保证干红葡萄酒的营养及感官品质。

表 3 酿酒红葡萄PPO活力、TP含量、BD及葡萄酒色值Pearson相关性分析Table 3 Pearson correlations among PPO activity, total phenolic content, the degree of browning of red wine grape and wine color

2.4 优质酿酒红葡萄品种的分类

图 1 27种酿酒红葡萄η值 (PPO活力/TP含量)聚类分析树状图Fig.1 Clustering of 27 red wine grape varieties by η (PPO activity/TP content) values

为了区分PPO活力低而多酚含量高的葡萄品种，以PPO活力与多酚含量的比值η(PPO活力/TP含量)为依据(表1)进行聚类分析。η越小，其PPO活力愈低，TP含量愈高。27种酿酒红葡萄η聚类分析树状图，如图1所示，在距离为5处划分可将27个葡萄品种分为4大类：第1类(3.23≤η≤8.49)，分别为蛇龙珠、黑赛比尔、赤霞珠、玫瑰香、黑赛林、梅鹿辄、卡马特、宝石解百纳、捷莱乌苏姆、塔乌西、品丽珠、巴柯、法国兰；第2类(10.07≤η≤13.73)，分别是塔夫里斯、马夫鲁特、红星吉里、盖吾莎、吉姆莎、佳美、红艾基；第3类(15.14≤η≤21.45)，依达、黑彼诺、佳丽酿、黑后、赫尔松、克里木波西；第4类(η为25.49)只有维比林。由于此方法不能客观地评价PPO活力及TP含量同时高或同时低的品种，如第1类的巴柯η为8.36(PPO活力33.75U/mL，TP含量4.04mg/g)，黑赛林η为6.43(PPO活力10.43U/mL，TP含量1.62mg/g。因此，为了更有效地对酿酒红葡萄品种进行划分，本实验依据PPO活力及TP含量各自的平均值进行象限分布，进一步优化适宜品种范围。

图 2 系统聚类中第一类13个酿酒红葡萄品种的PPO活力及TP含量象限分布Fig.2 Quadrant distribution between PPO activity and total phenolic content of 13 red wine grape varieties belonging to fi rst class of system clustering

由图2可知，区块划分将13个品种划分到4个区域，以PPO活力和TP含量的平均值为坐标轴，形成坐标系。第1象限：PPO活力和TP含量同时大于平均值(23.83U/mL，2.52mg/g)的品种，有巴柯、宝石解百纳；没有品种位于第2象限；第3象限为PPO活力和TP含量同时小于平均值的品种，分别是玫瑰香、黑赛林、捷莱乌苏姆、塔乌西、法国兰；第4象限为同时满足PPO活力小于总平均值(23.83U/mL)，TP含量大于总平均值(2.52mg/g的优良酿酒葡萄品种，分别是蛇龙珠、黑赛比尔、赤霞珠、梅鹿辄、卡马特及品丽珠，以蛇龙珠和黑赛比尔最佳，其PPO活力分别为16.41U/mL和16.87U/mL，明显低于大多数品种，而相应的TP含量分别为5.08mg/g和5.15mg/g，是TP含量平均值的2倍以上。赤霞珠葡萄作为目前世界上栽培最为广泛的酿酒红葡萄酒的品种，其PPO活力较低(19.30U/mL)，TP含量较高(3.71mg/g)。与赤霞珠相比较，蛇龙珠和黑赛比尔的PPO活力更低而TP含量更高，在酿造感官品质(L*)良好及营养价值高的干红葡萄酒方面，更具有发展潜力。

3 结 论

本实验测定了27个酿酒红葡萄品种的PPO活力、TP含量及BD，并分析了其与干红葡萄酒L*值的相关性。不同酿酒红葡萄品种PPO活力、TP含量及BD之间存在显著性差异，PPO活力与TP含量之间无显著相关性，但二者均与BD呈正相关(P＜0.05)，PPO活力对BD的影响大于TP含量。PPO活力、TP含量及BD均与干红葡萄酒L*值呈显著性负相关。按照η(PPO活力/TP含量)进行系统聚类将27个酿酒红葡萄品种划分成4大类，再利用平均值象限分布将系统聚类中第一类(3.23≤η≤8.49)切割到4个象限，以位于第4象限的6个酿酒红葡萄品种(分别是蛇龙珠、黑赛比尔、赤霞珠、梅鹿辄、卡马特及品丽珠)在PPO活力和TP含量方面表现最佳。该研究结果为酿造感官品质(L*)良好及营养价值高的干红葡萄酒的原料选择提供依据。

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