马柏林，罗桂杰，刘 博，谭 军

（1.江苏省宿迁市宿豫区农业技术推广中心，江苏 宿迁 223800；2.江苏省农业科学院 宿迁农科所，江苏 宿迁 223800）

大丽花轮枝孢锌离子结合蛋白（Verticillium dahlia Asp-f2 Like，VdAL），是一种新型生物工程蛋白。这种新型蛋白是从丝状真菌中分离得到的一种胞内可溶性蛋白，是不同于Harpin和Elicitin的新型蛋白激发子，拥有我国自主知识产权，能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长发育、改善作物品质，可作为一种新型的广谱、高效、多功能且无毒无害（LD50超过5 000 mg）的生物农药[1]。研究表明，施用VdAL对水稻具有增产作用[2]。但是，叶面喷施VdAL对宿晓红葡萄果实品质的影响，目前尚缺乏试验数据。因此，本试验进行了宿晓红葡萄坐果时在叶面2次喷施不同浓度VdAL的研究，并测定了不同处理宿晓红葡萄果实的生理指标，旨在评价不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实品质的影响，从而为VdAL的田间施用提供实践基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料：4年生中晚熟葡萄品种——宿晓红；试剂：VdAL，中国农业大学生物学院自主研发。

1.2 试验方法

试验共设5个处理：①叶面喷施清水（CK）；②叶面喷施VdAL，浓度比例为VdAL∶水=1∶15 000（处理1）；③叶面喷施VdAL，浓度比例为VdAL∶水=1∶7 500（处理2）；④叶面喷施VdAL，浓度比例为VdAL∶水=1∶5 000（处理3）；⑤叶面喷施VdAL，浓度比例为VdAL∶水=1∶3 750（处理4）。2019年5月15日、6月15日分2次喷施树冠，以叶背湿润不滴水为宜，采用随机区组排列，每小区每个处理随机选取3株生长健壮、长势一致的宿晓红葡萄进行试验。从果实膨大后期开始，每隔7 d 采样1次，直至果实采收，每次采样选取果穗3 穗，每穗不同部位均匀采取10粒果，每次每个处理共采收30粒果，测定宿晓红葡萄的生长发育状况，计算平均值。

1.3 生理指标测定方法

1.3.1 果实发育指标的测定 从花后果实萼片脱落开始，每隔10 d 用游标卡尺测定离地面1.2～2.0 m树冠冠层内30粒果实的横、纵径，计算平均值。用电子天平称量每个处理共30粒果实的单果质量，计算平均值。

1.3.2 果实内在品质的测定 葡萄待测样液提取：取葡萄样本，洗净去皮打汁，过8层纱布，移取10 mL滤液于100 mL 容量瓶中，定容，混匀，吸取5 mL的滤液于称量瓶中，称重，于100℃恒温干燥箱中干燥4 h，冷却（干燥器），称重，然后再次烘至恒重（两次称量相差小于0.1 mg）。称取烘干样品0.5～1.0 g（或干样粉末5～100 mg），放入大试管，加入15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却，过滤，滤液转入100 mL 容量瓶，并用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

1.3.2.1 可溶性固形物含量的测定 折光法[3]测定，3次重复，取平均值。测定方法：用手提式折光仪测量待测样液的折光率，在折光仪上直接读出可溶性固形物（TSS）含量，用“%”表示。

1.3.2.2 可滴定酸含量的测定 指示剂滴定法[4]测定，3次重复，取平均值。测定方法：取50 g 捣碎后的葡萄浆，定容至200 mL 容量瓶中，摇匀过滤，取50 mL 滤液加入酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH滴定至溶液颜色呈淡红色，且维持1 min 不褪色，记录消耗NaOH的体积。

1.3.2.3 可溶性总糖含量的测定 蒽酮—硫酸比色法[5]测定，3次重复，取平均值。测定方法：吸取1 mL适当稀释样液，加入5 mL 蒽酮试剂，混匀，于试管口盖上玻璃球，在沸水中煮沸10 min，取出在流水中冷却20 min后，在分光光度计620 nm 波长处比色，以样液蒸馏水调零，测定A620nm值。

1.3.2.4 VC含量测定 2.6-二氯靛酚滴定法[6（]GB 5009.86—2016）测定，3次重复，取平均值。

1.4 数据统计和处理

使用Excel 2010 软件进行数据整理，使用SAS 9.0 软件对所得数据进行方差分析和DUNCAN 多重比较。

2 结果与分析

2.1 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实横、纵径的影响

由表1可知，不同浓度VdAL处理对宿晓红葡萄果实横径有一定影响。整个果实膨大期内，除处理3的果实横径在果实膨大后第7天与处理2、处理4相比差异不显著（P>0.05）外，其他时期处理3的果实横径均显著高于对照和其他处理（P<0.05）。与果实膨大后第7天相比，果实膨大后第42天时，处理1、处理2、处理3、处理4、对照宿晓红葡萄果实横径的增幅分别为42.19%、50.00%、60.43%、49.62%、36.00%。果实膨大后第42天，处理3的果实横径分别比处理1、处理2、处理4、对照提高22.53%、12.63%、13.78%、31.18%。由此可见，处理3 能够显著提高宿晓红葡萄的果实横径。

表1 不同处理对宿晓红葡萄果实横径的影响 单位：mm

由表2可知，VdAL处理宿晓红葡萄对果实纵径的影响，与对果实横径影响的规律基本相似。果实膨大后第42天，处理1、处理2的果实纵径与对照相比差异不显著（P>0.05）；处理3、处理4的果实纵径显著高于对照（P<0.05），且处理3的果实纵径显著高于处理4（P<0.05），处理3的果实纵径分别比处理1、处理2、处理4、对照提高20.67%、16.77%、14.56%、21.48%。

2.2 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄单果质量的影响

由表3可知，喷施不同浓度VdAL 能显著增加宿晓红葡萄单果质量。自果实膨大后第14 天开始，不同处理宿晓红葡萄的单果质量均显著高于对照（P<0.05）。整个果实膨大期内，处理3的单果质量除在果实膨大后第7天与处理2 相比差异不显著（P>0.05）外，其他时期均显著高于对照和其他处理（P<0.05）。果实膨大后第42天，处理3的单果质量分别比处理1、处理2、处理4、对照提高32.56%、23.15%、22.77%、95.59%。

2.3 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实可溶性固形物含量的影响

由表4可知，VdAL处理宿晓红葡萄能够增加果实可溶性固形物的含量。在果实膨大后第7天、第14天时，处理1、处理2的果实可溶性固形物含量与对照相比差异不显著（P>0.05）；自果实膨大后第21 天以后，各处理果实可溶性固形物含量均显著高于对照（P<0.05）。处理3、处理4的果实可溶性固形物含量在整个果实膨大期内都显著高于对照（P<0.05），尤其是处理3 对提高果实可溶性固形物含量有最优的促进效果。果实膨大后第42天，处理3的果实可溶性固形物含量分别比处理1、处理2、处理4、对照提高71.92%、29.19%、28.76%、105.44%。

表3 不同处理对宿晓红葡萄单果质量的影响 单位：g

表4 不同处理对宿晓红葡萄果实可溶性固形物含量的影响 单位：%

2.4 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实可滴定酸含量的影响

由表5可知，VdAL处理宿晓红葡萄能够显著降低果实可滴定酸含量（P<0.05）。整个果实膨大期内，各处理果实可滴定酸含量均显著低于对照（P<0.05），各处理间果实可滴定酸含量也存在差异。果实膨大后第42天，处理3的果实可滴定酸含量显著低于其他处理（P<0.05），分别比处理1、处理2、处理4、对照降低35.98%、28.60%、16.01%、44.92%。

表5 不同处理对宿晓红葡萄果实可滴定酸含量的影响 单位：g/L

2.5 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实可溶性总糖含量的影响

由表6可知，VdAL处理宿晓红葡萄能够增加果实可溶性总糖含量。整个果实膨大期内，各处理果实可溶性总糖含量均显著高于对照（P<0.05），各处理间果实可溶性总糖含量也存在差异；处理3的果实可溶性总糖含量显著高于其他处理（P<0.05）；处理2与处理4 相比，二者的果实可溶性总糖含量差异不显著（P>0.05）。果实膨大后第42天，处理3的果实可溶性总糖含量分别比处理1、处理2、处理4、对照提高27.19%、11.69%、11.47%、34.89%。

表6 不同处理对宿晓红葡萄果实可溶性总糖含量的影响 单位：g/L

2.6 喷施不同浓度VdAL对宿晓红葡萄果实VC含量的影响

由表7可知，VdAL处理宿晓红葡萄对提高果实VC含量具有明显促进作用。在果实膨大后第14天和第21天，处理1的果实VC含量与对照相比差异显著（P<0.05），其他时期与对照相比差异不显著（P>0.05）。在整个果实膨大期内，处理3、处理4的果实VC含量均显著高于对照（P<0.05）。在果实膨大后第7天，处理3的果实VC含量与处理4 相比差异不显著（P>0.05），与处理1、处理2、对照相比差异显著（P<0.05）；其他时期处理3的果实VC含量均显著高于处理1、处理2、处理4和对照（P<0.05）。果实膨大后第42天，处理3的果实VC含量分别比处理1、处理2、处理4、对照提高45.11%、34.61%、32.73%、51.12%。

表7 不同处理对宿晓红葡萄果实VC含量的影响 单位：μg/g

3 结论与讨论

1978年科学家发现有一种蛋白能够对植物产生过敏反应（hypersensitive response，HR），这种蛋白主要来源于假单胞菌属和欧文菌属[7-9]。该蛋白能够刺激植物生长发育、改善作物品质，这主要是因为该蛋白能够诱导植物体内系列基因表达，激活植物自身生长防卫系统的类分子蛋白质产生持久的系统抗性[1，7]。近年来，我国通过遗传工程技术开展蛋白基因的研究和应用，取得了一定的成效，VdAL 是中国农业大学通过工程菌株发酵，特殊工艺制备而成的一种蛋白干粉。本试验研究表明，喷施不同浓度的VdAL 均能够改善宿晓红葡萄果实品质，尤其是喷施VdAL 浓度为1∶5 000时，可促进宿晓红葡萄果实横径的增粗和纵径的增长，促进果实膨大，显著增加单果质量（P<0.05），以及提高果实中可溶性固形物、可溶性总糖、VC的含量，同时降低果实中可滴定酸含量。

赵利辉等[10]研究发现，激活蛋白可诱导植物的防卫反应。肖庆会等[11]研究表明，在龙丰苹果果实膨大期对其喷施不同浓度的蛋白制剂VdAL可以显著改善苹果果实品质及提高单果质量。孙风清等[12]研究表明，育苗期叶面喷施1.25 g/L VdAL可以显著增强黄瓜幼苗的耐贮运性，提高黄瓜商品苗的贮藏质量。在本试验中，适宜浓度的VdAL可显著提高宿晓红葡萄果实品质（P<0.05）。这可能是因为VdAL 竞争结合E3，释放转录因子，调控防卫基因表达促进了宿晓红葡萄果实细胞的横向生长，激活植物自身生长防卫系统的分子蛋白质，促进叶绿素形成，并间接影响光合作用及糖和VC的形成，补充了果实生长时所需的营养元素，因此，喷施适宜浓度的VdAL可显著提高宿晓红葡萄果实品质。本试验只进行了VdAL对宿晓红葡萄果实品质影响的初步探讨，对其作用机理还需进一步研究。