吴剑锋，徐迪晖，赵海金

（1.解放军广州疗养院，广州 510515；2.南方医科大学南方医院消化科，广州 510515；3.南方医科大学南方医院呼吸科，广州 510515）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是各种慢性肝病共有的病理变化，表现为胶原为主的细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）在肝脏过度的沉积。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活是HF的中心关键环节，HSCs被激活后，其表型向肌成纤维细胞转化，合成大量α－SMA、胶原等基质成分而参与HF的发生发展［1］。糖尿病和HF关系密切，一方面慢性肝病可影响糖代谢；另一方面，近年来研究发现，糖尿病会促进慢性肝病HF的进展，是发生肝硬化的一个重要危险因素［2，3］。探讨高血糖在HF发病中的作用及其机制，有助于发现防治HF的新策略。本实验通过体外高糖（模拟糖尿病高血糖）处理人HSCs，观察研究高糖对人HSCs的活化作用及其机制，为临床防治糖尿病相关HF提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

D－葡萄糖、甘露醇购自Sigma Aldrich公司（USA），DMEM培养基以及特级胎牛血清（FBS）购自 Gibco BRL（USA），抗 TGF－β1抗体购自 Abcam（Cambridge，UK，ab64715），抗 MMP－2 抗体购自Sigma Aldrich（St.Louis，MO，SAB4501891），抗I型胶原抗体购自Abcam（ab34710），抗α－SMA抗体购自Santa Cruz Biotechnology（CA，sc－130619）。

1.2 细胞培养与处理方法

HSCs细胞由中山大学实验动物中心提供。在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。实验分组：正常对照组（normal glucose group，NG，5.5mmol／L葡萄糖）、高糖组（high glucose group，HG，30mmol／L葡萄糖）和渗透压对照组（osmolality control group，OC，5.5mmol／L葡萄糖＋19.5mmol／L甘露醇）。

1.3 Western blot测定蛋白的表达

HSCs细胞接种于60mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置30min，12 000r／min离心10min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5h，随后加入抗 TGF－β1、MMP－2、I型胶原和α－SMA抗体（1∶1 000），4℃过夜，用TBST洗3次，10min／次。……