陈咏君，田素飞，褚云卓*，郭丽洁，丁丽萍，李富顺

(1.中国医科大学附属第一医院检验科，辽宁沈阳 110001;2.沈阳医学院附属沈洲医院检验科，辽宁沈阳 110001)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是医院和社区获得性感染的常见病原菌之一，可以引起皮肤和全身的广泛感染［1-2］。社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(community-acquired methicillin-resistantStaphylococcus aureusCA-MRSA)感染主要侵犯皮肤软组织，感染类型包括疖、脓肿、毛囊炎、蜂窝织炎等，严重时可引起脓毒症，甚至导致坏死性肺炎。CA-MRSA可以产生多种毒素，主要有α型苯酚可溶解的调控蛋白(phenolsoluble modulins，PSMα)、葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)、葡萄球菌溶血素、杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)、表皮剥脱性毒素(exfoliative toxins，ETs)以及中毒性休克综合征毒素-l(toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1)等［3］。我国CA-MRSA中ST59型为常见的基因型［4-5］，但其相关的毒力因子尚无系统报道，本文检测了ST59型CA-MRSA的PSMα、PVL、SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因，以了解ST59的毒力因子，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 5株金黄色葡萄球菌菌株(P14，2997，E14，6048，6131)均来自2007～2008年中国医科大学附属一院门诊及住院患者的临床分离的非重复菌株，其中6048和6131分离自同一患者的不同标本，其余来自不同患者的皮肤软组织及血培养标本。5株菌的mecA基因均为阳性，SCCmecⅣ型［6-7］。5株金黄色葡萄球菌菌株经MLST分析，均为ST59型CA-MRSA。

1.1.2 主要试剂与仪器 细菌基因组提取试剂盒(博日生物技术有限公司);Tag酶及PCR相关试剂(宝泰克大连生物科技有限公司);PCR引物(上海生工有限公司合成);菌种鉴定卡(法国生物梅里埃公司产品)、VITEK-2全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司产品)、PCR9700(Gene Amp)、电泳仪(美国Bio-Rad公司产品)、HZQF160振荡培养箱(上海);超速低温离心机(贝克曼);紫外凝胶成像仪(美国Alpha Innotech)。

1.1.3 引物设计与合成 根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件及参考文献设计［8］，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PSMα、SEs、ETs、TSST-1、PVL 基因引物一览表Table1 PSM2、SEs、ETs、TSST－1、PVL gene Primers list

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用细菌基因组提取试剂盒，严格按照操作说明提取基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增体系 扩增反应总体积为25 μL，6×Buffer缓冲液5 μL，Taq酶(5 u/H1)0.25 μL，dNTP 3 μL，引物各4 μL，模板5 μL，加无菌去离子水至25 μL。

1.2.3 PCR反应条件 扩增SEs基因热循环参数为:95℃预变性4 min，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，循环30次，72℃延伸7 min;扩增ETA、ETB和TSST基因循环参数为:95℃预变性4 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，循环30次，72℃1 min，72℃延伸1 min;扩增PVL基因热循环参数为:94℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次，72℃延伸5 min。扩增PSMα基因热循环参数为:94℃预变性5 min，94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，72℃延伸10 min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 1 g琼脂糖粉末与100 mL 0.5×TBE缓冲液混合加热煮沸，冷却至80℃后，制备成1%的琼脂糖凝胶。2 μL上样缓冲液与5 μL PCR扩增产物混合后加入1%琼脂糖凝胶孔，10×TBE为电泳缓冲液，用水平式电泳槽140 V，电流为80 mA，时间为40 min。EB染色20 min，300 nm紫外灯观察结果，凝胶成像系统成像。

1.2.5 DNA测序 对PCR扩增阳性的PSMα和PVL基因片段委托上海生物工程有限公司进行序列测定，与GenBank序列数据库标准序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 毒力因子检出情况

5株ST59型CA-MRSA全部检出PSMα基因(见图1)和检出PVL基因(见图2);5株ST59型CA-MRSA均未检出SEA、SEB、SEC、SED、SEE、TSST-1、ETA、ETB基因。

图1 α型苯酚可溶解的调控蛋白(phenol-soluble modulins，PSMα)Fig.1 Phenol-soluble modulins，PSMα

图2 杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)Fig.2 Panton-Valentine leukocidin，PVL

2.2 测序结果

PCR扩增阳性的5株PSMα和5株PVL基因片段测序结果见图3、图4，与GenBank序列数据库标准序列进行比对完全一致。

图3 PSMα基因测序结果Fig.3 The results of PSMα gene Sequencing

图4 PVL基因测序结果Fig.4 The results of PVL gene Sequencing

3 讨论

社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)已经在世界各地广泛流行，不同于医院相关性MRSA(HA-MRSA)的显著特性是可产生多种毒素，如α型苯酚可溶解的调控蛋白、肠毒素、溶血素、表皮剥脱性毒素、杀白细胞素等，多侵袭既往健康的社区人群，且频繁发生坏死性肺炎及筋膜炎，给人类的健康造成极大的威胁。

目前国内尚未见过对ST59型CA-MRSA携带PSMα基因进行系统检测的报道。在本研究中的5株CA-MRSA，mecA基因均为阳性，SCCmec均为Ⅳ型，经MLST分析均为ST59型。5株ST59型CA-MRSA经PCR扩增后均携带PSMα基因和PVL基因［6-7］。近来的研究对于PVL基因在CAMRSA菌株流行和致病中所起到的作用存在分歧，但在本研究中5株ST59型CA-MRSA均检出PVL基因，因此认为PSMα基因和PVL基因是ST59型CA-MRSA的常见毒力因子。事实上，PSMα基因强烈的影响对于CA-MRSA的感染在小鼠的菌血症和脓肿模式已经显示的十分清楚［9］。在CA-MRSA的感染中PSMα基因具有很强的促炎和增强毒力的作用［8］。PSMα基因在ST59型CA-MRSA的感染中是否具有较强的促炎和增强毒力的作用将在今后的研究中继续证明。

本研究中的5株ST59型CA-MRSA均未检测出携带肠毒素SEA-SEE基因、TSST-1基因、ETA和ETB 基因，这与蔡朝阳等［10－11］报道阳性率为9.68%差异较大，考虑可能为不同标本，不同地域，不同自然环境，金黄色葡萄球菌流行菌株也不同，其携带毒素基因亦不一样。本研究中分离的标本均为患者的皮肤软组织及血培养标本，并无水疱或广泛皮肤脱落患者，考虑感染类型不同，ST59型CA-MRSA携带毒素基因也不同。

总之，ST59型CA-MRSA的毒力和致病机制非常复杂，在克隆传播和疾病的发病中可能涉及多种因素。人们一直在努力找到一种或几种能够确定的毒力因子来阐明ST59型CA-MRSA毒力增强的原因。对ST59型CA-MRSA毒力因子的认识可以促进抗ST59型CA-MRSA治疗的发展。因此有必要进一步研究上述毒力因子在ST59型CA-MRSA致病中的作用。

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