刘华戎，董文明

（1.云南农业大学校团委，云南昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

茶叶中含有多种生物碱，其咖啡因的含量占茶叶干物质总量的2.0%～5.0%，咖啡因亦称咖啡碱，化学名称为1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，化学式C8H10N402，相对分子质量为194.19，易溶于水。溶点为235 ℃～237 ℃，弱碱性，白色结晶粉末，无臭，味苦，有风化性[1]。能溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶剂。咖啡因是一种重要的医药工业原料，具有增加肾脏血流量、强心、利尿、兴奋神经中枢、消除疲劳等作用，因此，研究茶叶中咖啡因的含量，有助于我们适量饮用，正确、合理利用茶叶的各种保健功能[2]。与常规提取技术相比，超声波辅助提取具有快速、价廉、提取率高等优点[3]。针对超声波特有的能量，作为茶叶样品咖啡因提取前处理技术，采用三氯甲烷作为提取溶剂，离心萃取咖啡因，依据咖啡因在275.0 nm 处有最大吸收，用紫外分光光度计测定茶叶及茶叶制品中咖啡因含量，旨在建立一种测定茶叶及茶叶制品咖啡因含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

茶叶：2011 年昆明市市场随机购买，所有茶叶样品均置于60 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒重，粉碎，干燥器内保存、备用。

1.2 试剂

三氯甲烷、无水乙醇、二氯甲烷、石油醚：AR，国药集团化学试剂优先公司；咖啡因：AR，FARCO CHEMICAL 提供；亚铁氰化钾：AR，天津市化学试剂三厂；碱式乙酸铅：AR，天津市化学试剂三厂。

1.3 仪器

AE-100 电子分析天平：感量为0.000 1 g，梅特勒-托利多中国公司；UV-2401PC 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Anke TGL-10B 低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；格兰仕G70F20CN3L-C2HS3120型微波炉：格兰仕集团；超声清洗器：长沙科美分析仪器有限公司。

1.4 标准溶液的配制

准确称取咖啡因标准品0.050 00 g，用重蒸三氯甲烷溶解并定容至100.0 mL。取上述咖啡因溶液2.5 mL定容到25.0 mL 得到咖啡因工作液，分别取咖啡因工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，稀释并定容至10.0 mL，得到质量浓度分别为0.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL的咖啡因标准工作溶液。

1.5 样品处理

称取2.0 g（精确到0.000 1 g）粉碎混合均匀过60目筛样品置于250.0 mL 三角瓶中，加80.0 mL 煮沸蒸馏水浸泡10.0 min 后，将三角瓶放到超声波清洗器的盛水高度为40 mm 水槽中，超声15 min 后，转移到100.0 mL容量瓶中，加2.0mL200g/L 的亚铁氰化钾溶液和2.0 mL 200 g/L 的碱式乙酸铅溶液除去茶叶中的蛋白质，定容，过滤，滤液超声脱气后备用。液体样品除蛋白，超声脱气后备用。

2 结果与讨论

2.1 最佳提取条件的筛选

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取溶剂

咖啡因是存在于许多天然植物中的一类属于甲基黄嘌呤的生物碱，它在多种溶剂中的溶解性较好。因此，在茶、咖啡、饮料等体系中萃取咖啡因可用的溶剂种类较多，三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等均可用来萃取水相中的咖啡因[4]。按照1.5 样品处理步骤，研究无水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯等溶剂对普洱茶咖啡因含量萃取效率的影响。试验结果表明（见表1），几种溶剂均能准确分层，但三氯甲烷相对较好，且样品分层速度快，提取率较大，选择三氯甲烷作萃取溶剂。

表1 不同提取溶剂对咖啡因测定结果的影响Table 1 Effect of different extraction solvents on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.2 三氯甲烷用量

取1.0 mL 样液，分别添加5.0、10.0、15.0、20.0 mL三氯甲烷溶液经离心萃取后，测定不同用量三氯甲烷对茶叶的咖啡因含量的影响。试验表明，由图1 可知：三氯甲烷用量越大，咖啡因含量越高，但三氯甲烷属有毒污染溶剂，按最少量原则和最佳的溶剂比确保样液和萃取溶剂能准确分层，最终选定15.0 mL。

图1 三氯甲烷用量对红茶咖啡因测定结果的影响Fig.1 Effect of chloroform dosage on yield of caffeine content in black tea

2.1.1.3 混配方式

固定其他条件不变，试验了自动静止混合、手动混合、微波、离心等混配方式对萃取结果的影响，结果见表2。

表2 不同提取方式对红茶测定咖啡因测定结果的影响Table 2 Effect of different extraction method on yield of caffeine content in black tea

由试验结果可见，离心萃取的测定结果高于其他几种混配方式。

2.1.1.4 离心提取速率和时间[6]

研究不同离心速率和时间对萃取结果的影响，离心速率和离心时间搭配分别为组合（1）：2 000 r/min，20 min；组合（2）：2 500 r/min，15 min；组合（3）：3 000 r/min，10 min；组合（4）：4 000 r/min，15 min。由试验结果（图2）可见，离心速率为3 000 r/min，离心10 min 时咖啡因含量较高。

图2 离心速率和离心时间对红茶咖啡因结果的影响Fig.2 Effect of Centrifugal rate and time on yield of caffeine content in black tea

2.1.2 正交试验

在单因素试验的基础上，研究超声提取时间（A）、三氯甲烷用量（B）、离心萃取速率（C）、离心萃取时间（D）等四因素三水平L9（34）正交试验，影响因素及水平见表3。

表3 咖啡因含量测定最佳因素水平表L9（34）Table 3 Level and factor of orthogonal test L9（34）

表4 咖啡因含量测定优化筛选的试验方案Table 4 Orthogonal test of detemination caffine

正交试验结果表明，取样量为2.0 g、超声波水层深度为40 mm 时，最佳的提取条件为：超声波辅助提取时间15.0 min、每毫升样液三氯甲烷的用量为5.0 mL，离心萃取速率为2 500 r/min，离心萃取时间15.0 min。影响茶叶中咖啡因提取效果因素的主次顺序为：超声提取时间＞离心萃取时间＞离心萃取速率＞三氯甲烷用量。

2.2 方法的重复性试验

分别取普洱茶、绿茶、红茶饮料、绿茶饮料等样品，每个样品测定7 次，计算其标准偏差及变异系数。本法的精密度分别为0.15%、0.75%、0.38%和0.88%。

2.3 加标精密度试验

精密称取已测定咖啡因含量普洱茶的样品3 份，分别加人低、中、高3 种不同量的咖啡因标准品，按样品溶液制备方法并进行测定，结果见表5。加标回收率在98.56%～100.28%之间，符合分析测试要求。

表5 加标回收率试验Table 5 Test of sandard addition

2.4 本法和标准法差异显著性比较

选择红茶样品，用本法和标准法分别进行7 次平行测定，考察本法的精密度以及与表标准法的分析结果是否具有同一性。结果见表6（表中结果均为7 次测定红茶样品的平均值）。

表6 两种方法的差异显著性比较[7-8]（t 测试，显著水平0.05）Table 6 Significant analysis of two methods

由差异显著性比较结果可知（见表5）：本法和标准法之间差异的t 值为0.266，小于0.05 水平上的t值，即t=0.319＜t120.05，两种方法测定结果差异不显著，本法和标准法测定茶叶咖啡因含量，其结果具有同一性。

3 结论

1）采用超声波预处理和离心萃取技术测定了茶叶及茶叶制品中咖啡因含量，通过单因素试验和正交试验，当称样量为2.0 g、超声波水层深度为40 mm 时，确定了最佳的提取条件为：超声波提取时间15 min、三氯甲烷用量为15 mL，离心萃取速率为3 000 r/min，离心萃取时间10 min。萃取到的咖啡因三氯甲烷溶液加入适量的无水硫酸钠去除样品中的水分，用紫外分光光度计在275.0 nm 处测定茶叶及茶叶制品中咖啡因含量。

2）通过对法的重复性和加标回收率试验，结果表明，本法的精密度和加标回收率试验结果良好，可以用于茶叶及茶叶制品咖啡因含量的测定。

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[3]张茂升,龚丽芬,余彬彬,等.超声提取-超声波辅助固相微萃取色谱法测定蔬菜中的有机氯、菊酯类农药残留量[J].分析试验室,2008,27(4)：25-28

[4]叶海亚,陈亚东,彭振博.红茶中天然咖啡因的提取研究[J].化工生产与技术,2009,16(4)：10-12

[5]李楠,孙晶晶,杨静,等.微波提取茶叶中咖啡因工艺的研究[J].食品研究与开发,2007,28(10)：27-29

[6]丁明珍,邹建凯.离心萃取-紫外光谱法测定可乐饮料中咖啡因的含量[J].分析化学,2008,36(3)：381-384

[7]高岐.食品中脂肪的超声提取快速测定方法研究[J].食品工业科技,2008,29(4)：292-293

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