杜 娟，夏佳楠，沈 丽，王元元，王亚苹，张德芹

酪氨酸酶(TYR)是皮肤黑色素生物合成的主要限速酶，其化学结构为铜结合糖蛋白。在皮肤黑色素生物合成过程中，酪氨酸羟化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羟基吲哚转化生成吲哚醌，这些反应步骤均需TYR参与，TYR活性与黑色素合成量呈正相关[1]，TYR活性改变可引起色素障碍性皮肤病如白癜风。白癜风好发于暴露部位而影响美观，机体酪氨酸酶活性是影响白癜风的主要因素。2005年版《中国药典》记载，骨碎补、菟丝子外用消风祛斑[2]。本实验采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测菟丝子、骨碎补提取物对酪氨酸酶活性的影响，为菟丝子、骨碎补外用治疗白癜风提供药效学依据。

1 材料

1.1 实验仪器 TD-10001电子天平（天津市天马仪器厂）；Infinite M200微量多功能读板机TECAN。

1.2 药物及试剂 菟丝子药材：购于安徽亳州药材市场，产地：内蒙，批号201004-1，由天津中医药大学生药教研室李天祥老师鉴定为旋花科植物菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟种子。骨碎补药材：购于安徽亳州药材市场，产地：江西，批号201103-2。由天津中医药大学生药教研室李天祥老师鉴定为水龙骨科植物槲蕨（Drynaria fortunei Kunze J.Sm.）的干燥根茎。Tyrosinase（批号 #120M700，美国Sigma公司）；柚皮苷标准品（批号110422-200610）；L-DOPA（批号 #080M1712V，美国 Sigma公司）；磷酸缓冲液（批号P1010，北京索莱宝科技有限公司）；甲氧沙林（1g/L，批号2010004，重庆华邦制药股份有限公司产品）。

2 方法

2.1 试剂及药物的配制 菟丝子提取物的制备[3]：菟丝子药材粉碎过100目筛，称取药材粉末8g按照1∶14的比例置于112 mL 55%的乙醇中，60℃水浴振荡提取2次，每次2 h，合并提取液，浓缩，药渣溶于4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配成2g/mL的药液，实验时稀释至 2、1、0.5、0.25g/mL 不同浓度。

骨碎补提取物的制备[4]：60%乙醇回流提取3次，浓缩烘干后保存备用。配制：实验时称取骨碎补浸膏200 mg，溶于1 mL的二甲基砜（DMSO）中，配成200 mg/mL 的药液，用 PBS稀释至 100、50、25g/L 不同浓度。

柚皮苷标准品：批号110422-200610。配制：精密称取柚皮苷标准品2 mg，溶于0.2 mL的DMSO中，配成10g/L的溶液。实验时用PBS释至400、200、100、50 μg/mL 不同浓度。

L-多巴溶液（10mmol/L）：称取 197.19mg，用 PBS定容至 100 mL，现用现配（MW：197.19g/mol）。

酪氨酸酶溶液（143 U）：称取 13.28 mg（25 KU）蘑菇酪氨酸酶（1 881 U/mg），用PBS定容至25 mL，即1 KU/mL。分装-20℃保存，临用时室温平衡，稀释至实验所需浓度143 U/mL。

2.2 酪氨酸酶活性的测定 参照文献[5]方法。以蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法测定酪氨酸酶活性，反应混合物（20 μL 的样品+70 μL 143 U/mL 的蘑菇酪氨酸酶）37℃温育 10 min，加入 70 μL 10 mmol/L的L-多巴溶液，2 min后立即于475 nm处测其吸光度，模型组以PBS代替样品的反应混合物作为模型对照组。每个样品均设置一个空白对照组，以70μL PBS代替蘑菇酪氨酸酶。

菟丝子的提取物取 2、1、0.5、0.25g/mL 4 种不同浓度；骨碎补提取物取100、50、25g/L不同浓度；柚皮苷标准品取 400、200、100、50 μg/mL 4 种不同浓度。每一个实验重复3次。

按以下公式计算酶激活率[6]：酪氨酸酶激活率（%）=[（C－D）－（A－B）]/（A－B）×100。其中：A：未加样品的加酶混合液所测的吸收度；B：未加样品也未加酶的混合液所测的吸收度；C：加样品和酶的混合液所测的吸光度；D：加中药样品而未加酶的混合液所测的吸光度。

2.3 统计 采用SPSS 18.0软件包进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

见表1、表2。

表1 菟丝子提取物对蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表1 菟丝子提取物对蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：与甲氧沙林组相比，**P<0.01。

组别 浓度（g/mL） 激活率（%）甲氧沙林组 0.001 5.07±0.17菟丝子提取物 2.000 13.14±3.06**1.000 56.07±0.72**0.500 68.22±0.37**0.250 50.09±1.96**

由表1可见，菟丝子提取物的不同浓度对酪氨酸酶活性具有不同浓度的激活作用，且相比于阳性药甲氧沙林，各浓度菟丝子提取物对酪氨酸酶的激活率均差异有统计学意义，表明，菟丝子提取物具有激活酪氨酸酶活性的作用且优于甲氧沙林。

由表2可见，骨碎补提取物和其主要成分柚皮苷均对酪氨酸酶活性具有激活作用，相比于阳性药甲氧沙林，浓度为200、100g/L骨碎补的提取物和浓度为400、200 μg/mL的柚皮苷标准品差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），结果表明，骨碎补提取物和柚皮苷标准品具有激活酪氨酸酶活性的作用且优于甲氧沙林。

表2 骨碎补对蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

表2 骨碎补对蘑菇酪氨酸酶的激活作用（±s，n＝3）

注：与甲氧沙林组相比，*P<0.05；**P<0.01。

组别 浓度（g/L） 激活率（%）甲氧沙林组 1.00 5.07±0.17骨碎补提取物 200.00 67.44±17.23**100.00 35.41±6.42**50.00 16.03±1.68 25.00 9.58±3.60柚皮苷标准品 0.40 28.63±0.83*0.20 20.83±2.74*0.10 7.88±1.80 0.05 7.07±1.08

4 讨论

作为黑色素合成的关键酶，酪氨酸酶活性的异常可能导致皮肤色素生成的异常。白癜风是由多种原因引起的色素代谢障碍性疾病，主要原因是由于皮肤黑色素合成减少，其临床上以皮肤色素脱失斑为特征。由于酪氨酸酶是各种生物体内黑色素形成的关键酶，所以能够激活酪氨酸酶、增强其活性的药物，可促进黑色素的合成，有助于白癜风病损区色素的恢复[7]。本实验选用的阳性药甲氧沙林的主要成分补骨脂素[8]，补骨脂素已被证实是酪氨酸酶的激活剂，长期用作治疗白癜风的药物[9]。本实验证明菟丝子、骨碎补提取物体外对蘑菇酪氨酸酶的激活作用明显强于补骨脂素，提示菟丝子、骨碎补提取物中含有比补骨脂素更强的、作用机制不同的某些化学成分，在此基础上发展的新制剂可望有助于白癜风的治疗。有关菟丝子、骨碎补等对黑色素生成影响以及治疗白癜风的作用机制有待进一步研究。

[1]Iwata M,Corn TIwata S.The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins[J].J Invest Dermatol,1990,95(1):9-15.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社，2005：249－250.

[3]陈林林，吴 春，蒋意桥.菟丝子总黄酮提取工艺的研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2004，20（6）：644－647.

[4]韦英杰，陈 宁，王 静，等.正交实验法优选骨碎补提取工艺的研究[J].时珍国医国药,2004,15(11):750-751.

[5]Takayuli Hanamura,Eriko Uchina,Hitoshi Aoki.Skin-Lightening effect of a polyphenol extract from acerola(malpighia emarginata DC.)fruit on UV-Induced pigmenta-tion[J].Biosci biochem,2008，72(12):3211-3218.

[6]杨 柳,邓 艳.紫河车体外对黑素细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响[J].第一军医大学学报，2004，24（9）：1040-1044.

[7]沈 丽，张德芹，黄云英，等.骨碎补外用对实验性豚鼠白癜风的影响[J].天津中医药大学学报，2012，31（2）：92－94.

[8]Marwan M M,Jiang J W,Castrucci A M,et al.Psoralens stimulate mouse melanocyte and melanoma tyrosinase activity in the absence of ultraviolet light[J].Pigment Cell Res,1990,3(4):214-221.

[9]黄云英，张德芹.菟丝子外用治疗研究进展[J].天津中医药大学学报，2012，31（3）：190－192.