韩 梅，侯 雪

（四川省农科院测试中心，四川 成都 610066）

0 引 言

氨基甲酸酯类农药是一种高效、广谱型杀虫剂，母体结构为含氮合成的氨基甲酸酯衍生物，能抑制昆虫体内乙酰胆碱酯酶，阻断正常的神经传导，使昆虫中毒死亡[1]。氨基甲酸酯类农药对食品安全和生态环境存在潜在威胁，许多国家和地区对这类农药残留规定了严格的限量。

目前，氨基甲酸酯类农药的测定方法有很多[1]，主要有气相色谱法（GC）[2-3]、液相色谱法（LC）[4]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[5-6]、气相色谱串联质谱法（GCMS/MS）[7-8]、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[9]等。现在一般的产品标准，包括国家标准与行业标准的检测方法多为气相色谱法、液相色谱法，灵敏度较低，且阳性确证困难，尤其是对基质复杂的样品，不能准确定性、定量。

本方法以食用菌中常规气相色谱法分析中基质干扰最大的香菇为研究对象。香菇是世界第二大食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称。香菇在生长、储运过程中，为了防治病虫害，难免会使用化学防治方法，为了保证食品安全，需监测其农药的残留情况。本文采用体积排阻色谱-凝胶渗透色谱（GPC）法对样品进行净化，以除去香菇中氨基酸、多糖类等大分子物质，然后采用气相色谱串联质谱法对抗蚜威等6种具有代表性的氨基甲酸酯农药进行测定，建立了香菇中6种氨基甲酸酯农药的GPC净化及GC-MS/MS的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪:Varian 450 GC-320 MS/MS（美国Varian公司）；德国IKA高速匀浆机；涡旋混匀器；凝胶渗透色谱仪（美国J2 Scientific），配有内充Bio-Beads S-X3玻璃柱（内充凝胶22g，20cm×2cm）；旋转蒸发仪（瑞士 Büchi）。

丙酮、乙腈均为色谱纯；乙酸乙酯、环己烷为分析纯；去离子水；氯化钠为分析纯；克百威等6种农药标准购于北京中国标准技术开发公司标样开发部，均为100mg/L。

氨基甲酸酯农药标准溶液的配制：准确吸取100mg/L单一标液各1mL，置于50mL容量瓶中，用丙酮稀释定容至刻度，此混合储备液浓度为2.0mg/L。根据实验需要，用正己烷-丙酮（9∶1）稀释成不同浓度的混合标准使用液。

样品来源：市场上的抽检样。

1.2 样品制备

（1）提取净化。准确称取25.0g粉粹试样放入匀浆机中，加入50.0mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2min后，用滤纸过滤或抽滤，滤液收集到装有5～7 g氯化钠的100mL具塞比色管或具塞量筒中，收集滤液40～50 mL，盖上塞子，剧烈震荡1 min，在室温下静置60 min，使乙腈相和水相分层。

（2）浓缩。吸取10.00mL（相当于5g样品）乙腈溶液，在40℃水浴旋转蒸发至近干，准确加入乙酸乙酯+环己烷（1∶1）10.0mL 的混合溶剂溶解残渣，用 0.45μm有机系滤膜过滤后移入10mL样品瓶中，供凝胶净化。

（3）GPC净化。流动相为环己烷+乙酸乙酯（1∶1），流速为4.7 mL/min，进样量为5.0 mL，收集8～20 min流出的组分于旋蒸瓶中，40℃蒸发至近干，用正己烷-丙酮（9∶1）准确定容到 2.5mL，供质谱测定。

1.3 标准系列制备方法

分别吸取一定量的混合标准储备液（2.0mg/L）于 10 mL容量瓶中，用正己烷-丙酮（9∶1）稀释定容至刻度，配成 0.010，0.040，0.100，0.200，0.500mg/L等一系列的标准使用液。

1.4 农药色谱条件

气相色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30m×0.25mm×0.25 μm）；进样口（1079）温度：60℃保持 1.0 min，以200℃/min升到250℃，保持10min再以200℃/min降到60℃；PTV进样方式：不分流进样；进样量：5.0μL。柱温：50℃保持3 min，以25℃/min升至150℃，不保持，再以10℃/min升温至260℃ 保持2min。载气:高纯氦气（99.999%），恒流1.2mL/min。

质谱条件：电子轰击离子源（EI）；电子轰击能：70 eV；离子源温度：230℃；传输温度：280℃，溶剂延迟：7 min。碰撞气(氩气)为 1.5 mTorr。各组分的保留时间、母离子、特征碎片离子、碰撞电压、驻留时间见表1。

表1 6种氨基甲酸酯农药的分析参数

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

本法前处理提取方法参照标准方法NY/T 761-2008[4]。实验表明，乙腈在提取农残方面比乙酸乙酯更具有优势[9]：（1）乙腈的饱和蒸气压较乙酸乙酯更低，因此挥发性更小一些；（2）使用乙腈能保证较高的提取效率，能提取的农残种类范围更广；（3）较之丙酮、乙酸乙酯等萃取溶剂，用乙腈萃取，共萃物更少，在提取这一步就减少了部分干扰。因此，本实验采用乙腈提取。

2.2 净化方法的选择与优化

香菇中含有丰富氨基酸、蛋白质、多种矿物质和多糖等营养成分，在气相色谱测定中会产生大量的干扰成分，采用柱层析等净化方法也不能有效地将干扰杂质除去，同时农药成分有可能损失，且操作步骤繁杂。但是选用中性、多孔的Bio-Beads SX-3作为GPC柱填料，使用自动化GPC系统不仅能进行有效地分离净化，而且还大大节约了时间和溶剂[11]。本实验选用体积比为1∶1的乙酸乙酯-环己烷溶液作为流动相，流速为4.7mL/min，按1.2（3）方法分时间段收集样品，分别检测各段流出液中组分的含量，发现8min以前的收集液中未检出农药，三羟基克百威在8min就开始流出，其他的农药在9min后开始流出，18min以后的收集液中未检出农药。考虑到凝胶色谱柱有可能有拖尾情况出现，于是在农药流出的时间段后多收集2 min；因此，最后确定样品过凝胶柱净化的收集时间为第8～20min，共收集13min流出液。

2.3 GC-MS/MS方法的建立

香菇基质成分比较复杂，含有大量的易挥发性物质，即使是经过净化后的样品，应用气相色谱和单级质谱法分析时，都会发生严重的干扰现象，所以要进行准确地定性定量需结合高选择性的MS/MS技术，以提高检测的准确性和灵敏度。为此，需要对待测目标农药的色谱条件进行一系列参数设置和优化，选择合适的特征离子。本实验先通过色谱分离来确定6种农药组分的保留时间。比如确定了速灭威保留时间为9.41min，然后通过对6种农药组分进行单级质谱扫描来确定每种农药组分的主要碎片离子，一般是选择分子离子或相对丰度较大、高质量端的一级碎片离子，且能产生较强响应的子离子的碎片离子作为母离子[12]，其他响应较强的碎片离子作为子离子。比如速灭威的分子离子为165（m/z），选它作为母离子，其他响应较强的离子有108（m/z）、107（m/z）可作为子离子，然后应用子离子扫描模式（MS/MS）分别对选定的母离子进行二次轰击，获得其子离子谱图，组成多反应监测通道。最后分别在不同的碰撞能量（5～50V）下对多反应监测方法进行优化，选择能使监测到的子离子产生最强响应的碰撞能量作为最终碰撞能量，从而得到优化后的多反应监测条件，结果见表1。

2.4 方法的线性关系和检出限

称取不含农药的香菇空白样品，采用上述的提取净化条件，经GPC净化后旋转蒸发至近干，用正己烷-丙酮（9∶1）定容，配成了基质空白溶液。按1.3的方法，将2.0 mg/L的6种农药的混合标准溶液稀释定容，配制成质量浓度分别为0.010，0.040，0.100，0.200，0.500 mg/L的系列标准溶液，按照1.4色谱分析条件对上述一系列标准工作溶液与空白样品进行测定，以各氨基甲酸酯组分的峰面积（y）对质量浓度（x，μg/L）绘制标准曲线。以每种农药最低质量浓度点定量离子的响应值与空白样品中噪声响应的3倍外推法计算检出限（LOD），方法的线性关系、检出限结果见表2。从表2中的数据看出，在10～500μg/L质量浓度范围内，该方法的线性关系良好，相关系数均大于0.99；6种农药目标物的检出限为0.046～6.4 μg/kg，可以满足定量分析的要求。

2.5 加标回收率及相对标准偏差

向空白样品定量添加上述6种农药的混合标准溶液，添加浓度分别为 20，40，100 μg/kg，添加后按照“1.2”节所述步骤进行提取、浓缩、净化和测定，用优化后的EI-MS/MS参数平行分析5次，加标回收率和相对标准偏差见表2。加标回收谱图及空白谱图见图1和图2。从表2可以看出，添加水平为20，40，100μg/kg时，6种目标物在样品中的平均回收率为84.0%～123.9%，相对标准偏差（RSD，n=5）为 0.30%～7.7%，不大于15%，符合痕量残留分析。从空白与样品总离子流图（图1与图2）来看，虽然有杂峰，但比气相色谱干扰小的多，不干扰目标离子，所以采用母离子与子离子的GC-MS/MS多反应监测模式可以增强定性结果的可靠性，且由于本底值大大降低，定量时检测的灵敏度可以得到较大的提高。采用本方法所得到的基质谱图中杂质峰少，对6种农药目标物均无明显干扰现象，从而在根本上解决了基质成分非常复杂的香菇中农残检测工作易出现的干扰问题。

表2 6种氨基甲酸酯的线性方程、相关系数（r2）、方法检出限（LOD）、平均回收率与相对标准偏差（n=5）

图1 空白香菇样品的总离子流图

图2 香菇空白样品加标回收的总离子流图

3 结束语

本文建立了乙腈提取、凝胶渗透色谱净化、气相色谱-串联质谱法检测香菇样品中6种氨基甲酸酯类农药残留的方法，较好地排除了香菇样品中基质的干扰，减少了本底值，降低了方法检出限。此外，前处理方法省时省力，且自动化程度较高，提取效率也比较满意，净化的溶剂毒性较小，在过小柱时避免使用毒性大的甲苯、二氯甲烷等洗脱溶剂。本方法可应用于食用菌中基质干扰大的香菇类样品中氨基甲酸酯类农药残留的快速、简便定性定量分析。

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