刘晓英, 刘光荣, 朱晨瑜, 何聪芬,*, 祝 钧

(1.无限极(中国)有限公司,广东广州 510665;2.北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室,北京 100048)

苦瓜(Momordica charantia L.)别名凉瓜、癞瓜、锦荔枝等,葫芦科属一年生蔓性草本植物.之所以呈甘苦味是因为其含有罗汉果苷和苦瓜素等成分[1].大量研究证明,苦瓜具有辅助降血糖、抗氧化、增强免疫力等功效[2-6],另外以苦瓜果汁对糖尿病大鼠进行治疗可以使血清中非酯化胆固醇、磷脂及甘油三酯水平降低,高密度脂蛋白-胆固醇水平升高,趋于正常.进一步研究证明,苦瓜能够减少甘油三酯分泌以及微粒体甘油三酯转运蛋白的mRNA的表达,是栽脂蛋白B的分泌以及甘油三酯的合成分泌的抑制剂,具有一定的预防肥胖的功效[7-9].对苦瓜提取物(由无限极有限公司提供)的健美功效及安全性进行研究.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦瓜提取液,实验中用蒸馏水或其他溶剂将苦瓜提取物配置为1.0,5.0,10.0,30.0,50.0 mg/mL溶液;鸡血红细胞,无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,北京梅里亚维通实验动物有限公司;NaCl,甲醇,丙醇均为分析纯,北京化学试剂公司;十二烷基硫酸钠,分析纯,北京拜尔迪生物技术有限公司;斑试器,圆形,直径12 mm,北京北医投资管理有限公司;L-抗坏血酸2-葡糖苷(ascorbic acid 2-glucoside,AA2G),原料级,北京贝丽莱斯生物化学有限公司;豚鼠,原料级,北京军事医学院动物中心;W1002-2-500型甘油测定试剂盒,北京科达宏伟生物技术有限公司.

1.2 仪器与设备

4K15型冷冻离心机,美国Sigma公司;Purelab Vltra型超纯水机,英国ELGA公司;UV2300型紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;FMe-100B型摇床,上海福玛实验设备有限公司;SMZ1000型解剖显微镜,日本NIKON公司;SHP-150型生化培养箱,上海森信实验仪器有限公司;MINI-V/PCR型超净工作台,上海森信实验仪器有限公司;FT-ZDQ型手提快速照蛋器,北京春明方通电子有限公司;MSE-1600型透皮吸收仪,天津市正通科技有限公司;SN151000377C型酶标仪,美国Thermo Science Multiskan Go公司.

1.3 实验方法

1.3.1 功效性实验

1.3.1.1 透皮吸收实验

透皮吸收实验参照文献[10-11].向透皮吸收仪恒温槽中加入适量水,开启电源和恒温槽磁力搅拌,设定恒温槽中水温为37士0.1℃.将制备好的鼠皮用铁夹子固定在两室扩散池之间,向垂直扩散池的接受池内加入5.0 mL接受液,放入透皮吸收仪恒温槽中预热,设定接受池搅拌速度为700 r/min.向供给池内分别加入供给液(即待测苦瓜提取液),以保鲜膜封住上口.开始记时,当样品渗透0.5,1,1.5,2,3,4 h时,分别取样0.5 mL置具塞离心管中,在最大吸收峰处测量吸光度(实验中测得苦瓜提取物在490 nm处出现最大吸收峰),计算透光量.累计透过量计算见公式(1).

式(1)中,Q为累积透过量,mg/cm2;S为透皮扩散面积,cm2;V1为Franz扩散池接受液体积,mL;ρn为第n次取样时接受液的质量浓度,mg/mL;ρi为第i次取样时接受液的质量浓度,mg/mL;V2为取样量,mL.通过式(1)计算后,作出累积量与时间的曲线图,及最终透过累积量.

1.3.1.2 促进脂肪分解能力实验

按1 g/mL的比例加入制备好的脂肪底物与待测苦瓜提取液,37℃反应2 h,取10 μL,加入190 μL工作液(甘油含量测定试剂盒内含),37℃反应10 min.550 nm下测透光值,将其带入甘油含量标准曲线中计算甘油增加量,依此分析脂肪被分解程度.

1.3.1.3 脂肪酸合酶抑制实验

脂肪酸合酶抑制实验参照文献[12-14].将10 μL待测苦瓜提取液加入由1.8 mL磷酸缓冲液,25 μL 乙酰辅酶 A,50 μL 丙二酰辅酶 A,50 μL 还原型辅酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)以及脂肪酸合酶组成的活性体系中,在340 nm下连续测定NADPH的质量浓度变化,进而计算样液对脂肪酸合酶的抑制作用情况.

1.3.2 安全性实验

1.3.2.1 红细胞溶血实验

红细胞溶血实验参照文献[15-16].用质量比为0.1%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl-sulfate,SDS)检测所采集红细胞的完整性,同时在显微镜下观察红细胞的形态和细胞膜的完整性.将样品用磷酸盐缓冲液(PBS)分别稀释成待测质量浓度,用其检测样品的刺激性.实验分为2组:1)阳性对照组(0.1%SDS)和2)待测苦瓜提取液组.

1.3.2.2 鸡胚绒毛尿囊膜实验

鸡胚绒毛尿囊膜实验参照文献[17-19].采用6 d龄鸡胚放入(37.5 ±0.5)℃,相对湿度为60% ～80%的恒温孵箱中孵育1 d,标记、开窗放入无菌中速定性滤纸小片(直径5 mm),然后用灭菌透明胶封口,培养24 h后,加待测苦瓜提取液(溶剂换为生理盐水),设置0.1%的SDS为阳性对照组,生理盐水为阴性对照组.加样剂量为每次100 μL,每天1次,共3 d.实验结束后,鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)用甲醇∶丙酮 =1 ∶1(v∶v)的固定液固定,用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳及卵壳膜,完整剪下CAM,标记药膜中心点,拍照观察.

1.3.2.3 人体斑贴实验

人体斑贴实验参照文献[20-21].用待测苦瓜提取液浸润滤纸后放入斑试器内,对照孔为空白对照(不置任何物质).将样品和空白对照均贴于受试者的前臂曲侧,用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上,持续24 h,去除斑试器后间隔30 min,待压痕消失后观察皮肤反应.在除去斑试器48 h后再观察一次皮肤反应.

2 结果与分析

2.1 功效性检测结果

2.1.1 透皮吸收实验

图1 苦瓜提取物随时间变化的累积透过量Fig.1 Cumulative penetration change with time of Momordica charantia extracts

样品在不同质量浓度下的透过累积量随时间的增加均呈递增趋势,说明苦瓜提取物有透皮吸收效果(见图1);随质量浓度的增加,样品的透过率逐渐降低(见表1).综合透过累积量与透过率2个因素得出,样品起始质量浓度为1.0 mg/mL时效果最佳.

表1 苦瓜提取物的透过率Tab.1 Transmittance of Momordica charantia extracts

2.1.2 促进脂肪分解能力实验

苦瓜提取物能够促进底物中的脂肪分解,使甘油含量上升,说明该提取物具有促进脂肪分解的能力,且随质量浓度的增高而增高(见图2).但即使在最大质量浓度50.0 mg/mL时也未达到50%.

图2 苦瓜提取物促进脂肪分解能力实验Fig.2 Experiment of promoting lipolysis of Momordica charantia extracts

2.1.3 脂肪酸合酶抑制实验

结果显示,苦瓜提取物对脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)有抑制作用,且随着质量浓度的加大,抑制作用加强,见图3.说明苦瓜提取物能够抑制脂肪的合成,当质量浓度达到50.0 mg/mL时FAS抑制率达到50.50%.

图3 苦瓜提取物FAS抑制实验Fig.3 Experiment of inhibiting fatty acid synthase of Momordica charantia extracts

2.2 安全性检测结果

2.2.1 红细胞溶血性实验

按照RBC Test System方法中对结果的判定:若样品溶血率高于20%,则判定为有刺激性,若低于则无刺激性.结果显示,50.0,30.0 mg/mL的苦瓜提取物的溶血率较高,均大于界值20%,对红细胞的刺激性较大;10.0,5.0,1.0 mg/mL样液溶血率均低于20%,可判定无刺激性,见图4.

图4 苦瓜提取物红细胞溶血性实验实验结果Fig.4 Red blood cell hemolysis test of Momordica charantia extracts

2.2.2 鸡胚绒毛尿囊膜实验

图5是阴性对照组,各组鸡胚大多数血管较少,甚至可见无血管区域.载体放置区域多为无血管区或血管较少的分布区,可见鸡胚血管细小,微血管生成较少.图6是阳性对照组,鸡胚已完全死亡.图7a至图7e为苦瓜样液组,其中图7a为加样质量浓度1 mg/mL组,与阴性对照组比较,血管数目略有增加,血管分支数也有所增加;图7b为加样质量浓度5 mg/mL组,血管数目与分支数较1 mg/mL质量浓度组进一步增加,分布较零乱;图7c为加样质量浓度10 mg/mL组,较5 mg/mL组血管零乱程度加重,各药物组CAM血管开始向载体生长集中;图7d为加样质量浓度30 mg/mL组,较10 mg/mL质量浓度组,血管管径增宽,分布零乱无序,出现断裂血管,且平行实验中一只在距第一次加样72 h后死亡;图7e为加样质量浓度50 mg/mL组,可明显看出溶血现象,且平行实验中一只在距第一次加样48 h后即死亡.综上可见,苦瓜提取物的刺激性依质量浓度的增加而增加,在低质量浓度时刺激性较小,但是在高质量浓度,如30,50 mg/mL时刺激性比较大,甚至会出现鸡胚致死现象,见表2.

2.2.3 人体斑贴实验

对苦瓜提取物进行人体斑贴实验,结果见表3,此次实验中苦瓜提取物斑贴实验结果均符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》的要求.

表2 苦瓜提取物对鸡胚存活情况的影响Tab.2 Effect of Momordica charantia extracts on survival condition of chicken embryoes

图5 阴性对照(生理盐水)Fig.5 Negative contrast(normal saline)

图6 阳性对照(0.1%SDS)Fig.6 Positive contrast(0.1%SDS)

图7 不同质量浓度苦瓜样液的鸡胚绒毛尿囊膜Fig.7 Different concentrations of Momordica charantia extracts for chicken embryo villus allantoic membrane

表3 苦瓜提取物人体斑贴实验Tab.3 Patch test of Momordica charantia extracts

3 结 论

透皮吸收实验证实,各质量浓度的苦瓜提取物均能够透过皮肤;促进脂肪分解能力实验与脂肪酸和酶抑制实验证实该提取物具有促进脂肪分解的能力与抑制脂肪合成的能力.体外安全性实验——红细胞溶血性实验与鸡胚绒毛尿囊膜实验结果显示苦瓜提取物在较低质量浓度即1,5,10 mg/mL时安全无刺激;人体斑贴实验结果显示该提取物在任意检测质量浓度下对人体均无刺激性.经过一系列的功效评价实验和安全性研究,确定苦瓜提取物具有一定的健美功效,且在较低质量浓度下安全无刺激,推荐选取10 mg/mL作为外用健美产品的添加量.

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