马全瑞孙金萍马江波刘广辉梁 亮赵 剑马新伟秦 毅

不同时间点用红花注射液治疗脑出血大鼠对出血灶周围神经细胞Caspase-3的影响※

马全瑞1孙金萍2马江波1刘广辉1梁 亮1赵 剑1马新伟1秦 毅1

目的比较早期不同时间用红花注射液治疗脑出血（ICH）模型大鼠对大鼠行为学及血肿周围神经细胞Caspase-3的影响。方法ICH大鼠模型制造成功后，在出血后0、6、12、24h用红花注射液治疗，同时设置ICH对照和正常对照。大鼠ICH 72h后处死，取脑，连续切片。结果神经功能评分结果显示，红花预防组较ICH对照组降低；Caspase-3蛋白免疫组化结果显示，红花预防组阳性细胞数较ICH对照组减少；ICH 6h前各时间点给药较6h后给药阳性细胞数多；ICH 6h后不同时间点给药，脑血肿周围Caspase-3阳性细胞数随着用药时间的推迟而逐渐增多。结论红花注射液治疗ICH，使ICH大鼠的神经功能得到一定程度的恢复；ICH 6h以后尽早使用红花注射液治疗脑出血的效果较好；红花注射液对脑出血的保护机制可能是通过抑制细胞内Caspase-3蛋白的表达而延缓细胞凋亡。

脑出血；细胞凋亡；红花注射液

脑出血（ICH）是一种常见的脑部疾病，目前治疗 ICH的手段和方法虽较以往有很大进步，但ICH患者的死亡率仍较高。近年来的临床资料显示，应用红花等活血化瘀药物治疗急性期ICH具有一定的疗效，但适当的给药时机仍存在争议。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物实验用230～280g SD大鼠（雌雄对半），由宁夏医科大学实验动物中心提供。ICH大鼠模型制造成功后，在出血后0、6、12、24h时腹腔注射红花注射液（剂量为1.5ml/kg/d），正常对照和出血对照腹腔注射等量生理盐水。每组6只大鼠。另外，红花预防组是用红花治疗24h后再制作ICH模型。每日进行神经功能评分一次，各组大鼠均于ICH后第72小时处死。

1.1.2 主要试剂红花注射液（批号070304，雅安三九药业有限公司）；Ⅶ型胶原酶（sigma公司）；Caspase-3多克隆抗体（武汉博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 根据脑立体定位图谱用大鼠脑立体定位仪确定Ⅶ型胶原酶的注射位置（中线右侧旁开3.0mm，前囟后 0.2mm）；用牙科钻在注射位置打孔，以可见硬脑膜为准；用微量进样器注射，0.5U/μl Ⅶ型胶原酶和6.25U/μl肝素的混合液0.26μl。

1.2.2 免疫组织化学染色石蜡切片，二步法进行切片的免疫组织化学染色，其中一抗为兔Caspase-3多克隆抗体，DAB显色后，在200 倍光镜下观察、拍照、计数，计算平均值（观察范围为血肿周围2、4、6、8、10、12时钟点六个位置中选择五个不重复视野区）。

1.3 结果分析利用SPSS 11.5对数据采用单因素方差分析，显著性水准取α≤0.05。

2 结果

2.1 行为学评分依据Berderson评分标准对各组大鼠进行行为学评分，详见表1。

2.2 免疫组织化学细胞核或细胞浆中呈棕黄色着色的细胞判断为Caspase-3阳性细胞。ICH对照组及红花预防组的阳性细胞多集中在血肿周围脑组织，正常对照组也可见少量阳性细胞。与相同时间点的ICH对照组相比较，不同时间点红花预防组的凋亡细胞数目明显减少（P＜0.01）。在不同时间点的红花预防组之间进行比较，结果发现术后 6h和 12h开始用红花治疗ICH的效果明显优于其它时间点用红花治疗ICH的效果，详见表2。

表1 ICH后各组大鼠的神经功能评分[(±s),n=6]

表1 ICH后各组大鼠的神经功能评分[(±s),n=6]

注：▲P＜0.01，VS ICH对照组

组别 术前24h 术后0h 术后6h 术后12h 术后24h正常对照组 0 0 0 0 0 ICH对照组 2.67±0.52 2.83±0.41 2.83±0.41 2.67±0.52 2.83±0.41红花预防组 2.00±0.63▲ 2.17±0.41▲ 1.67±0.52▲ 2.00±0.63▲ 2.17±0.41▲

表2 各组大鼠脑血肿周围Caspase-3阳性细胞记数[(±s),n=6]

表2 各组大鼠脑血肿周围Caspase-3阳性细胞记数[(±s),n=6]

注：▲：VS相同时间点的ICH对照组，P＜0.01；●：VS术后0h的红花预防组，P＜0.01；◆：VS术前24h的红花预防组，P＜0.01；★：VS术前24h的红花预防组，P＜0.05

组别 术前24h 术后0h 术后6h 术后12h 术后24h正常对照组 3.33±1.50 3.83±2.32 3.50±1.38 4.50±1.38 5.00±2.00 ICH对照组 65.50±8.89 63.67±9.16 68.00±9.30 67.83±5.53 67.00±4.98红花治疗组 52.33±6.31▲ 54.50±8.14▲ 38.33±10.46▲●◆ 40.33±6.17▲●★ 45.83±7.25▲

3 讨论

脑出血（ICH）后神经细胞死亡的主要途径之一就是细胞凋亡[1]。各种动物实验表明，ICH后神经细胞凋亡在ICH后4～6h开始出现，48～72h达到高峰[2]。目前认为，哺乳动物的细胞凋亡通路至少由死亡受体通路和线粒体通路构成，但是这两条凋亡途径并不是孤立的，它们后期的共同途径是激活Caspases信号通路，其中Caspase-3在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位，是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶[3]。

中医学认为离经之血便为瘀血。如唐宗海在《血症论》中曰：“既是离经之血，虽是清血鲜血，亦是瘀血”。中医学认为中风的本质是血瘀，治疗中风的根本也应该是活血化瘀，只是在治疗时机上存在较大争议。众多医家将活血化瘀药物多在ICH的亚急性期（3d或以后）开始使用。

红花为一种常见的活血化瘀类中药，味辛微苦、性湿，归心、肝经，是活血通经、祛瘀止痛之良药。本研究使用红花注射液治疗ICH模型大鼠，其结果显示，无论从行为学评价，还是从凋亡相关蛋白Caspase-3方面评价，与ICH对照组相比较，使用红花注射液治疗ICH大鼠有明显的保护效果。欧芹等在小鼠衰老模型上也观察到红花能够降低脑细胞凋亡率[4]。其次，对比ICH后不同时机使用红花注射液治疗ICH大鼠的效果，结果显示，与ICH 6h以后用红花注射液治疗组相比较，大鼠ICH的同时使用红花注射液治疗或在ICH前使用红花注射液预治疗均能明显增加ICH血肿周围Caspase-3阳性细胞数。另外，在制作ICH模型的同时给药治疗，观察到有1例模型血肿周边出现新鲜出血灶，提示脑出血 6h内使用红花注射液治疗有可能造成脑内二次出血。可能与ICH同时使用红花注射液治疗抑制了血小板聚集[5]，加重ICH有关。因此，在ICH 6h以内应慎用红花注射液。在大鼠ICH 6h后的三个不同时间点使用红花注射液治疗 ICH，其 Caspase-3阳性细胞又逐渐增多，提示ICH 6h以后尽早使用红花注射液干预 ICH的效果比较理想，与文献[6-8]报道一致。推测，红花注射液对ICH大鼠的保护作用可能与抑制 Caspase-3蛋白的表达并降低神经细胞的凋亡有关。红花注射液对ICH的保护机制有待于进一步深入的研究。

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[3] 金伯泉.细胞和分子免疫学[M].2版.北京：科学出版社,2001：202-208.

[4] 欧芹,魏晓东,孙鹏,等.红花黄色素对衰老模型小鼠脑细胞凋亡的影响[J].中国康复医学杂志,2006,21(6)：504.

[5] 陈文梅,金鸣,吴伟,等.红花黄色素抑制血小板激活因子介导的血小板活化作用的研究[J].中国药学杂志,2000,35(11)：741-744.

[6] 况时祥.活血化瘀药治疗脑出血急性期探要[J].中医药学刊,2004,22(8)：1513-1514.

[7] 陈汝兴.应加强脑血管疾病活血化瘀治疗的研究[J].中国中西医结合急救杂志,2000,7(3)：131-132.

[8] 董福峰,王新鹤.活血化瘀法治疗脑出血[J].时珍国医国药,2000,11(6)：546.

R743.34

A

1673-5846(2013)09-0029-02

1宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，宁夏银川 750004

2宁夏医科大学总医院病理科，宁夏银川 750004

教育部“春晖计划”合作项目基金（Z2011054）、宁夏高等学校研究重点项目基金（NGY2013056）和宁夏回族自治区自然科学基金（NZ12189）

秦毅，教授，宁夏医科大学基础学院人体解剖学教研室。E-mail：qinyi9166@163.com。