林耀盛, 刘学铭,*, 钟炜雄, 陈智毅, 王思远,杨荣玲, 杨春英, 赵晓丽

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,广东广州 510610;2.陆河县伟能食品有限公司,广东汕尾 516722)

青梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)又称“酸梅子”、“果梅”等,为蔷薇科李属果实[1].我国是青梅的原产地,主要集中在广东、四川、浙江、江苏、福建及台湾等18个省市.广东地区尤其适合青梅的生长,是我国青梅的主要产区之一,广东产青梅具有酸度高的特点[2].青梅是一种药食两用果实,不仅营养丰富,还具有许多保健功能[3-4].青梅含有丰富的有机酸、矿物质、维生素、黄酮等成分[5],具有调节机体酸碱度、抗疲劳、清除自由基等功效,是一种养生保健良品.

青梅具有高酸低糖特点,由于酸度过高而不宜鲜食,是典型的加工型水果.在青梅的传统加工中,加盐腌制是保存青梅原料的重要手段之一,也是后续加工产品质量控制的重要环节之一.长期以来,青梅腌制并没有得到深入而系统的研究,基本上是凭腌制师傅的经验进行.同时,对腌制废液(梅卤)的成分分析也鲜见报道,给梅卤的利用造成一定的困难.随着青梅制品加工的极速发展,高酸高盐的梅卤废弃,流入农田或河流,给环境造成一定污染.孙世鑫[6]等曾对青梅腌制过程中主要成分的变化规律进行探索,并提出生产中适宜选用中等和高等成熟度的梅果进行腌制,但未涉及腌制过程中青梅中主要特征组分有机酸的变化.本文以青梅为原料,经过对腌制过程中青梅果肉和腌制液主要成分测定分析,并对其有机酸的分析建立高效液相色谱法,通过探索其参数的变化规律,为进一步开发利用青梅加工、建立产品质量标准提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

实验鲜青梅为青竹梅品种,2012年4月21日采自广东省汕尾市陆河县东坑镇大新横坑村青梅种植区,由广东省汕尾市陆河县伟能食品有限公司提供.

草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸,均为色谱纯,美国Sigma公司;磷酸二氢钾、磷酸、AgNO3、NaOH、盐酸、乙酸锌、酒石酸钾钠、硫酸铜、亚铁氰化钾等均为国产分析纯.

1.2 实验仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪,包括DAD检测器、Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱;ALC210.4型电子天平,德国赛多利斯;SB 25-12 DTD型超声波清洗器,宁波新芝生物科技公司;Sartorius PB-10型pH计,德国赛多利斯;ZD-2型自动电位滴定仪,上海雷磁公司;TD6型离心机,长沙湘智离心机仪器公司;HR2006型搅拌机,飞利浦有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 青梅腌制

工艺流程为：青梅→清洗→晾干→筛选分级→加盐腌制→加压→加盖→阴凉放置腌制.一般生产中每千克鲜梅一次性加盐300～320 g,本实验室为使盐分进入青梅果肉,每千克青梅加盐量达400 g,每日搅拌均匀,腌渍后第2 d开始取样.

梅胚用水为自来水清洗,根据青梅直径分为S、M、L、2L、3L五个等级,实验选取中等成熟度L～2L等级的青梅,具有青梅特有芳香味,其总酸含量较高[7],从实际生产经验中,在腌渍青梅的塑料桶内每放一层青梅依次撒上一层食盐,直至最上层食盐将青梅完全覆盖,放置23～25℃阴凉处腌渍.在生产中为使青梅脱水,以青梅重的50%实施压力[8],随腌渍液渗出而加压变小,每天辅以搅拌,充分混合均匀.

1.3.2 分析方法

糖酸盐的测定是在腌渍24 h后开始定期对青梅果肉和腌渍液分别进行取样,测定其主要成分别为盐分、总酸及还原糖含量变化,测定方法参照以下标准.

1.3.2.1 盐分测定

采用GB/T 5009.42—2003硝酸银沉淀滴定法.

1.3.2.2 总酸测定

采用GB/T 12456—2008方法,采用 pH电位法,以柠檬酸计.

1.3.2.3 还原糖测定

采用 GB/T 5009.7—2008方法,采用直接滴定法.

青梅的测定：称重5.0 g去核果肉研磨至浆状,全部转移至100 mL溶液瓶中,定容过滤后抽取10 mL测定.

腌渍液的测定：移液管吸收5.0 g腌渍液原液至100 mL容量瓶中,加水定容后取10 mL测定.

1.3.2.4 有机酸测定

采用HPLC法,检测波长的确定是利用二极管阵列DAD检测器对不同有机酸物质在190～400 nm紫外光分别扫描,得到最优的检测波长.

参考文献[9-10]方法稍加改进.液相色谱柱为Zorbax SB-Aq分析柱4.6 mm×150 mm×5μm;流动相A为甲醇,流动相B为0.01 mol·L-1KH2PO4水溶液(用磷酸调pH值为2.65),流动相A与流动相B体积比为3∶97,流速0.8 mL·min-1;柱温25℃,紫外检测波长210 nm,进样量20μL.

标准品溶液的制备：精密称取减压干燥至恒质量的草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸对照品各10.0 mg,用纯净水溶解后定容于10 mL容量瓶中,用0.22μm微孔滤膜过滤.

青梅果肉测试样品制备时,准确称取去核的青梅果肉10.0 g,用搅拌机打浆至浆状,全部转移至250 mL容量瓶中,流动相溶液定容,定容后离心,取上清液过0.22μm微孔滤膜,待测.

腌制液样品制备时,每次从塑料桶中取搅拌均匀腌渍液,吸取5.0 g渗出至250 mL容量瓶中,流动相溶液定容,用0.22μm微孔滤膜过滤,待测.

2 结果与分析

2.1 腌制过程中盐分、总酸和还原糖含量的变化

按照1.3.2.1的方法,在腌渍24 h后开始取样,1～7 d取样1次/1 d,9～21 d取样1次/2 d取7次,25～49 d取样1次/4 d连续取7次,分别对青梅果肉和腌渍液取样后,分析测定其盐分变化,如图1.从图1可以看出,腌制过程中,腌制液中盐分向果实中渗透,使得青梅果实中盐分含量逐渐增大,而腌制液中盐分含量逐渐降低.腌制19 d以后,腌制液与果实中盐分含量趋于平稳状态,渗透达到平衡,盐分不再变化.当加盐量实际为每公斤鲜梅400 g时,果肉含盐量为24.42%,腌制液含盐量为27.06%.

依照1.3.2.2和1.3.2.3方法,取样方法同盐分测定,并测定果肉和腌渍液中总酸和还原糖,如图2和图3.从图2和图3总酸和还原糖含量变化情况上看出,腌制过程中,果肉中有机酸和还原糖逐步向腌制液中扩散,引起青梅果肉的有机酸和还原糖浓度逐步降低,腌制液中含量相应升高,当在19～21 d之间曲线趋于平缓,果肉与腌制液的参数变化稳定,浓度差已经逐步缩小达到平衡状态.从图2和图3都发现,腌制液中有机酸和还原糖的含量都比青梅果肉中的含量高,这是因为青梅果实内水溶液中的这些成分的含量是达到内外的液-液平衡的,但青梅中还含有大量不溶性膳食纤维等不溶性成分,从而导致果肉中食盐、总酸、还原糖等成分总含量小于腌制液,这与孙世鑫[6]等的研究结果一致.

图1 腌制过程中盐分质量分数变化Fig.1 Variation of salt content in pickling process

图2 腌制过程中总酸质量分数变化Fig.2 Variation of total acids content in pickling process

图3 腌制过程中还原糖质量分数变化Fig.3 Variation of reducing sugar content in pickling process

在腌制过程中,腌制液中盐分向青梅果实中渗透,而果实中水分、有机酸和还原糖向外扩散,并形成腌制液.随着腌制的进行,腌制液和青梅果实中水分以及盐分、总酸和还原糖含量逐步趋于平衡,是一个动态平衡的过程,扩散与渗透两者都有被动运输,这是由于青梅果实内外溶液的浓度差异调节存在.当两者浓度达到相近时,形成所谓的等渗溶液时,扩散与渗透就达到平衡状态[11].

2.2 有机酸谱变化

2.2.1 青梅果肉及腌制液有机酸分析方法研究

2.2.1.1 标准曲线的绘制

准确称取一定量的草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸,用超纯水配成不同浓度的标准有机酸混合溶液,进样20μL,分别进行HPLC分析,以色谱峰面积与标准品浓度绘制标准曲线,有机酸的浓度与色谱峰的面积呈良好的线性关系;线性回归方程分别为y=7 006.4x+2.076 4,R2=1.000 0;y=22 183x-1.126 9,R2=1.000 0;y=21 011x+0.808 2,R2=0.999 9;y=1 528.6x+0.696 7,R2=1.000 0;y=834.74x+0.401 9,R2=1.000 0;y=2 516.6x+0.096 3,R2=1.000 0;y=923.43x-0.092 6,R2=1.000 0.结果显示,表明线性关系良好,适用于定量分析.

青梅果肉与腌制液有机酸HPLC色谱图如图4和图5.从图4和图5测定有机酸图谱中看出,腌制过程中腌制液有机酸和果肉中发现7种有机酸,分别是草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸;与文献报告的一致,其中含量最高是柠檬酸,其次是苹果酸以及草酸,这3种有机酸图谱比较突出,也是青梅有机酸具有特色的色谱峰.同时,由图4和图5可见在腌制过程发现,这也是有机酸的丰富性特点,为我们下一步研究工作提出新的思路,为青梅特有的有机酸谱为作进一步的探索.

2.2.1.2 有机酸测定的加标回收率及精密度

取青梅果肉和腌渍液样品各2份,1份作为空白,另1份加入一定量的标准有机酸溶液,对某一种浓度的有机酸混合标准溶液在特定色谱条件下做HPLC分析,重复操作6次,测定各有机酸的测定回收率和相对标准偏差(RSD),见表1.

由表1看出,用高效液相色谱法测定青梅果肉和腌制液中有机酸的含量,可操作性强,该方法准确可靠,回收率高达99.3% ～111.6%以上,结果精密度高重现性好,RSD＜1.13%;结果显示,本法具有较好的重复性与灵敏度,适用于定量分析,该处理样品的方法具有较高的回收率.

图4 青梅腌渍液中7种有机酸图谱Fig.4 Chromatograms of 7 organic acids in pickling liquid

图5 青梅果肉中7种有机酸图谱Fig.5 Chromatograms of 7 organic acids in plum pulp

表1 有机酸的回收率和相对标准偏差Tab.1 Recovery rate and relative standard deviation of organic acids

2.3 腌制过程中青梅果肉与腌制液液相有机酸谱变化

按照1.3.2.4方法,腌渍24 h后开始定期取样,前面7 d每隔24 h分别取一次青梅果肉及腌渍液,7 d后每隔48 h取样后,通过HPLC法得出标准曲线浓度和出峰面积的线性关系,相应得出青梅果肉和腌渍液七种有机酸的浓度结果,如表2和表3.

表2 青梅果肉中有机酸质量分数测定Tab.2 Determination of organic acids in greengage pulp-mg/g

表3 青梅腌制液中有机酸质量分数测定Tab.3 Determination of organic acids in greengage bittern-mg/g

从表2和表3总酸和还原糖含量变化可以看出,在19～21 d取样果肉和腌渍液的变化曲线趋于平缓;腌制过程中果肉中有机酸总量向腌制液中扩散,果肉中总量变小,腌制液中含量增高,这和总酸测定结果一致.结果可见,青梅果肉和腌制液中柠檬酸质量浓度比例最高,达到总酸量的80% ～90%,其次为苹果酸,琥珀酸含量最低.这与周蓉芳[12]研究发现,青梅含多种天然有机酸,其中柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琉拍酸等有机酸含量高(总有机酸平均质量分数为6.79%),其中以柠檬酸为主,占总酸量的89%左右研究结果一致.由于本文通过HPLC研究发现不同物质最大吸收波长并不一致,本文优化测定条件,由于选取在210 nm波长下,并不完全满足各种有机酸的最大的吸收光谱,其次腌渍的青梅果肉及腌渍液的液相色谱图4和图5也显示有机酸较为丰富而且提取有机酸的方法不一致,因此造成HPLC方法测定的酸含量与采用GB/T 12456—2008方法测定的总酸含量有一定差别.果肉与腌制液中都含有柠檬酸、苹果酸、草酸这3种主要的有机酸,这可成为青梅有机酸的特征图谱,为接下来有机酸指纹图谱的建立奠定了基础.

腌制过程中,从青梅梅胚与腌制液的外观变化情况发现1)梅胚明显褪色,叶绿素从果实渗透到腌制液中,使得腌制液呈现黄绿色或茶绿色;2)在腌制液高酸度环境下,青梅果肉中所含叶绿素中镁离子被氢离子取代产生脱镁叶绿素,使得青梅颜色变成淡茶绿色[13],这可综合为青梅腌制的终点判断,也是青梅高酸的特色.

3 结论与展望

本实验通过对腌制过程中青梅及腌制液的盐分、有机酸和还原糖等主要成分的变化规律特性研究,发现盐分约为25%,有约46% ～50%的还原糖和有机酸进入到腌制液中.成分分析表明,青梅腌制液具有较高的有机酸含量及其他营养物质,流入农田或河流,不仅污染了环境,而且浪费了有用资源.由此可见,青梅腌渍液[14](梅卤)含有较为丰富的营养和保健价值,而当前我国对梅卤并没得到合理利用,不仅可以作为食品的酸味调节剂[15],也可为运动饮料消除疲劳[16].

本研究发现,该方法不仅快速、准确,同时具有较好的重复性与灵敏度;本研究利用HPLC对青梅果肉及腌制液的多种有机酸含量测定,其中发现以草酸、柠檬酸以及苹果酸为青梅有机酸的特色色谱图峰形,表征青梅及其制品的品质,这为评价青梅的营养和保健价值有一定的意义,并为青梅及制品的深加工提供可靠科学依据.通过研究了青梅果肉及其腌渍液的有机酸谱变化规律,利用有机酸谱找到青梅及其加工产品内在品质进行控制和鉴别的手段.

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