刘永峰, 高俊岭, 徐 阳, 冉仁森

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

环腺苷酸(cyclic adenosine-3′,5′-monophosphospate,cAMP),溶于水,具有环状结构,性质稳定,对酸、碱、热都相当稳定,存在于多数生物体内,调节着生物体内的物质代谢,对细胞代谢及多种生理效应具有关键作用[1-2].医学研究已经也证明至少有40多种重大疾病与cAMP的代谢有关,人体内缺乏cAMP会导致恶性肿瘤、癌症、失眠健忘、贫血、心血管疾病等众多疾病的发生[3].目前,对于食品及食品原料中cAMP的研究,仅在枣中取得了一定的进展.张明娟等[4]用 HPLC法测定了8种枣果中cAMP的含量,其最高含量为375.61μg/g,最低为46.01μg/g;张岩等[5]用 HPLC测定浓缩枣汁中cAMP含量为4.556 mg/L.马志科等[6]报道了从鲜羊奶中提取cAMP的方法,并利用放射免疫方法测定了cAMP含量,但有关牛奶中的cAMP研究尚未见有相关报道.

牛奶中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组成,蛋白质含量为3.0% ～3.7%,其中约80%为酪蛋白(酪蛋白至少由10种不同蛋白质组成,是几种含磷蛋白质的复合体),乳清蛋白为18% ～20%,乳中主要的乳清蛋白有β-乳球蛋白、α-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和眎、胨;剩余的为一些含氮化合物,属于非蛋白氮(如氨、游离氨基酸、尿素、尿酸、肌酸、嘌呤碱等及少量含氮维生素中的维生素态氮)[7].通过标准罗兰分离法测定,牛乳中氮分布为76%的酪蛋白、18%乳清蛋白和5%左右的非蛋白氮[8].在生物化学、食品科学及其他研究领域中,人们经常用到蛋白或多肽的沉淀剂,其中三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)应用最为广泛[9].TCA对蛋白的沉淀主要归功于3个氯原子的独特作用[10],TCA作为蛋白质变性剂,使蛋白质构象发生改变,暴露出较多的疏水基团,使之聚集沉淀[11].因此,本实验借鉴前人在枣、羊奶上的提取和测定方法,首次采用TCA沉淀蛋白法对牛奶中的cAMP进行分离提取,通过HPLC测定牛奶中cAMP含量,建立一种牛奶中cAMP分离提取方法.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

新鲜牛乳,购于陕西省西安市郊农户家中,于4℃条件下冷藏保存,至实验使用.

cAMP标准品,色谱纯,德国Sigma公司;甲醇,色谱纯,加拿大Promptar公司;三氯乙酸、磺基水杨酸、乙醇、磷酸二氢钾均为分析纯.

1.1.2 仪器

高效液相色谱仪,美国Waters公司;色谱柱,HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),美国Agilent公司;TU-2000型紫外可见分光光度计,日本日立公司;RE-52AA型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;D5-RZ型离心机型,湖南湘仪集团.

1.2 实验方法

1.2.1 样品去乳脂

将300 mL鲜乳使用医用纱布过滤,分装至20个离心管,预热至35～40℃,然后5 000 r/min,离心10 min,取下层去脂后的牛奶,混合.

1.2.2 样品去乳蛋白

将去脂后的牛奶,装在27个15 mL离心管中,每管10 mL.分别用质量分数为10%,15%,20%的TCA溶液处理,每个离心管中分别加不同质量分数TCA 4,6,8 mL,35℃沉淀10 min后,1 000 r/min,离心10 min,取上清液1滴,放入黑色比色板孔中,加1滴质量分数为20%磺基水杨酸检测,如出现白色沉淀,证明还有蛋白质存在,继续沉淀、离心,直到无白色沉淀为止,过滤,取无色上清液分别至27个离心管中.

1.2.3 样品去乳糖

将27个离心管中去蛋白后的滤液的分别置于旋转蒸发仪中,75℃浓缩,将提取液浓缩到占初滤液体积1/10～1/15时,冷却浓缩液至20℃,保持数小时,然后放入4℃的冰箱过夜,形成乳糖结晶于容器底部.取上清液于1.5 mL的离心管中,离心5 min,取上层液体,即为 cAMP溶液,并称重液体质量.

1.2.4 cAMP的HPLC测定

取cAMP标准品溶液,对其进行紫外全波长扫描,根据最大吸收率,确定其检测波长为259 nm.本研究流动相的选择参考张倩等[12]采用的方法,对cAMP进行定性.HPLC测定牛奶中cAMP含量的色谱条件为流动相采用V(甲醇)∶V(双蒸水)=10∶90,其中双蒸水中磷酸二氢钾的浓度为0.05 moL/L.检测波长为259 nm,色谱柱为HC-C18柱,流速1.0 mL/min,检测温度为室温,进样量为20μL;采用保留时间法定性[13],出峰时间为3.4 min.

1.2.5 样品中cAMP含量的测定及统计分析

实验共设置3个TCA质量分数水平和3个TCA用量水平,共9个处理,每个处理3次重复.每个样品溶液分别过0.45μm滤膜,进样进行HPLC测定.

根据式(1),计算出每个样品中cAMP的质量浓度.

式(1)中v为制备样品溶液浓缩后的体积,mL;c为HPLC测定样品溶液中cAMP质量浓度,μg/mL;v1为制备样品溶液所用牛奶的体积mL.

每个样品中cAMP质量浓度在不同处理下分别计算,所有数据采用SPSS18.0软件进行单因素9水平方差分析,并进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 样品中cAMP的色谱图

样品cAMP的色谱图与标准品色谱图分别为图1和图2.图1表明,样品中 cAMP保留时间为3.374 min,而图2中标准品的保留时间为3.389 min,所有样品中cAMP保留时间均与cAMP标准品的保留时间一致,并且样品中的目标峰与其他峰分离效果都较好.推测其他峰有可能是环鸟苷酸、明胶等物质.

图1 样品溶液中cAMP的色谱图Fig.1 Chromatogram of cAMP in sample solution

2.2 样品中cAMP质量浓度的测定

图2 cAMP标准品溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of cAMP in standard solution

TCA处理牛奶样品溶液中cAMP质量浓度的测定结果见表1和图3.可知,不同质量分数TCA处理组之间比较,质量分数为10%TCA处理组cAMP质量浓度显著高于其他2个组(P＜0.05).不同用量相同质量分数TCA处理组之间比较,8 mL TCA处理组cAMP质量浓度较其他两组显著降低(P＜0.05),而4 mL和6 mL处理组之间的cAMP质量浓度差异不显著(P＞0.05).不同质量分数且不同用量的TCA处理组之间比较,发现4 mL和6 mL 10%质量分数TCA处理样品时,cAMP质量浓度为最高(P＜0.05),如图4;其次是4 mL和6 mL 20%质量分数TCA处理样品时cAMP质量浓度;8 mL 15%质量分数TCA处理样品时cAMP质量浓度最低(P＜0.05).因此,牛奶中 cAMP分离提取时,若选用TCA沉淀乳蛋白方法,最佳TCA处理质量分数为10%,选择用量为4～6 mL,尽量避免选用8 mL的TCA用量.选用10%质量分数TCA溶液处理优于15%和20%质量分数,可能是因为浓度过高会破坏cAMP的生物学结构,造成cAMP含量减少.因此,综合考虑,应选择4 mL 10%的三氯乙酸处理.

表1 牛奶样品中cAMP质量浓度的测定结果Tab.1 Determination results of cAMPcontents in milk samples-μg/mL

图3 牛奶样品中cAMP质量浓度测定结果Fig.3 Determination results of cAMPcontents in milk samples

图4 最佳TCA处理组合的样品溶液色谱图之一Fig.4 One chromatogram of sample solution obtained from processing combination of TCA

3 讨论与结论

本研究通过离心去除乳中脂肪,采用不同质量分数不同用量TCA沉淀乳中蛋白质,再浓缩乳糖,分离提取cAMP,选用HPLC测定了牛奶中cAMP质量浓度.不同质量分数TCA处理组之间比较,10%TCA处理组cAMP质量浓度显著高于其他2个组(P＜0.05);不同用量相同质量分数TCA处理组之间比较,8 mL TCA处理组cAMP质量浓度较其他两组显著降低(P＜0.05);不同质量分数且不同用量的TCA处理组之间比较,4 mL和6 mL 10%质量分数TCA处理样品时,cAMP质量浓度为最高(P＜0.05).选用TCA沉淀乳蛋白方法提取牛奶中cAMP时,4 mL 10%质量分数的TCA最佳处理工艺测定cAMP质量浓度为(29.02±1.58)μg/mL.

本研究工艺同样适用于乳清、乳酪副产物、不合格原料牛奶.乳清是在制造奶酪时,从牛奶中分离出来的液体部分,最主要成分就是乳蛋白.目前生产1 t干奶酪排放9 t乳清,每年世界上有上亿t的乳清等待利用和处理,数量相当大.而cAMP的获得,一般采用人工合成方法,国内仅有的几家公司采用核糖核酸为原料生产cAMP,成本在12万元/kg以上,国外厂家如Sigma公司cAMP生产成本高达178.5万元/kg.本实验通过研究牛奶中cAMP的分离提取工艺,最终将建立一套cAMP提取工艺;该工艺的建立,为从乳清、乳酪副产物、不合格牛奶中提取cAMP提供了理论基础,从而将大大降低cAMP生产成本,变废为宝,增加产品的附加值.

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