冯洁，伦永志，李越，武会娟，李宝明，魏玲，张小莉，王雪蕾，迟庆

1 大连大学医学院辽宁省高校生物物理学重点实验室，辽宁大连 116622

2 大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116622

3 北京市理化分析测试中心，北京 100094

癌症病变过程中最重要的步骤是肿瘤细胞的浸润和转移，其关键取决于肿瘤细胞的某种分泌物能够水解细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)和基底膜(Basement membranem,BM)。肿瘤细胞先分泌尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,uPA)，此激活物为一种丝氨酸蛋白酶，可激活纤溶酶原产生纤溶酶(Plasmin,PLM)；PLM 继而降解ECM，同时还能激活前基质金属蛋白酶成为基质金属蛋白酶，后者参与细胞外基质蛋白的水解作用；最终ECM 与BM 被水解，肿瘤细胞得以扩散[1]。因此，干预uPA 水平或功能可以达到治疗肿瘤的目的，其中尤以Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制因子抑制uPA 活性最为直接也最具有临床应用前景[2-4]。

本实验室利用SSH 技术研究HBV RT/DNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR 验证及生物信息学方法确定该基因属于一种新的Kazal 型Serpin，命名为Hespintor

(GenBank Accession No.DQ438947)。Hespintor cDNA 全长为285个核苷酸，编码94个氨基酸。蛋白质序列分析表明，Hespintor 编码的94个氨基酸可分为3部分：N 端1～23个氨基酸残基为信号肽；第35～94个氨基酸含一个典型的Kazal结构域；N 端信号肽与Kazal 结构域间的24～34位氨基酸残基构成了连接区[5]。

pET-40b(+)原核表达载体具有2个显著特点：一是含有T7启动子，可被宿主细胞提供T7 RNA聚合酶识别，T7 RNA 聚合酶的转录效率比大肠杆菌RNA 聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，并大量表达融合蛋白；二是载体上携带Dsbc·Tag、His·Tag 和S·Tag，诱导表达的35 kDa 标签蛋白对目的蛋白的结构及生物学活性影响很小，特别是分别位于目的蛋白前后的His·Tag 为进一步纯化重组融合蛋白提供了最佳亲和位点，而且两者之间有凝血酶(Thrombin)及肠激酶(Enterokinase)酶切位点，便于纯化后将标签蛋白切除。

本研究将从 HepG2细胞中克隆得到的Hespintor Kazal 型结构域编码区亚克隆至原核表达载体pET-40b(+)中，采用IPTG 诱导带有融合标签蛋白的Hespintor-Kazal 重组蛋白的大量表达。经诱导条件的优化筛选，获得Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的高效表达，再经Ni2+柱及Q 柱两步纯化及柱上复性，最终得到具有特异性抑制胰蛋白酶水解活性的纯化重组蛋白，为下一步的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒及菌株

pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆载体、大肠杆菌 DH5α为本实验室保存；大肠杆菌Rosetta(DE3)、原核表达载体pET-40b(+)引自北京市理化分析测试中心；pMD 19-T Simple Vector 购自宝生物工程(大连)公司。

1.1.2 引物

根据 Hespintor 基因序列(GenBank Accession No.DQ438947)，设计序列特异性的含有限制性核酸内切酶(BamH Ⅰ/Hind Ⅲ)酶切位点的引物F (5′-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3′)、R (5′-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCAT ATTTTTC-3′)，由宝生物工程(大连)公司合成。

1.1.3 主要试剂

Restriction Enzyme Starter BOX、Permix Ex Taq Version 2.0、λ-Hind Ⅲ digest 、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程(大连)公司；PageRuler Prestained Protein Ladder 购自美国Fermentas 公司；鼠抗人His·Tag 单克隆抗体(一抗)购自科百奥公司；羊抗鼠HRP-IgG (二抗)购自中杉金桥公司；牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(活性≥250 NF U/mg)购自美国Amresco 公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)购自美国Sigma 公司；Ni2+柱(Ni2+-Histrap FF crude 5 mL)、Q 柱(Histrap Q FF column 1 mL)购自美国GE Healthcare 公司；考马斯亮蓝G250购自索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 原核表达载体的构建和鉴定

以pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆质粒为模板，PCR 扩增Hespintor Kazal 型结构域编码序列，3%琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收。将纯化的目的基因片段与 pMD 19-T Simple Vector 室温连接过夜，转化DH5α感受态细胞，碱裂解法提取质粒后测序鉴定，证明目的基因片段已正确插入T载体中；再用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ从T 载体上酶切目的基因片段，3%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，与经过同样酶切的pET-40b(+)原核表达载体连接，转化大肠杆菌 Rosetta(DE3)，碱裂解法提取质粒后酶切鉴定。

1.2.2 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的诱导表达及条件优化

转化有 pET-40b(+)/Hespintor 的 Rosetta(DE3)菌株接种至 LB 液体培养基(氯霉素34µg/mL、卡那霉素10µg/mL)中，37℃振荡培养过夜，按比例扩大培养，选择不同诱导条件进行优化，分别观察诱导时间、IPTG 终浓度、诱导温度对目的蛋白表达量的影响，每个条件做3组平行。离心收集菌体，15% SDS-PAGE进行分析，确定最适诱导条件。

1.2.3 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的纯化复性与鉴定

利用Western blotting 确定重组蛋白的表达。将最适条件诱导获得的菌体(上清保留备用)超声破碎，用8 mol/L 尿素溶液溶解沉淀(即包涵体)，离心后收集上清。用A 液(8 mol/L 尿素,0.5 mol/L NaCl,20mmol/L 咪唑；pH 8.0)平衡Ni2+柱，上清抽滤脱气后上柱，A 液继续冲洗，用B 液(0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑；pH 8.0)进行蛋白复性，梯度洗脱程序由0% B 至100%B，复性时间为150 min。该过程中将融合蛋白液从8 mol/L 尿素缓慢降至0 mol/L 尿素，变性的融合蛋白重新折叠形成具有生物活性的空间结构，即柱上复性，整个过程在低温环境下进行。尿素去除完全后用C 液(0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑；pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱峰，15% SDS-PAGE 分析。用D 液(20 mmol/L Tris-HCl；pH 8.0)平衡Q 柱，将Ni2+柱纯化后的样品用D 液稀释后上样，用E 液(20 mmol/L Tris-HCl,1 mol/L NaCl；pH 8.0)进行梯度洗脱，收集洗脱峰，15% SDS-PAGE 分析。Bradford法测定重组蛋白浓度。

1.2.4 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的活性鉴定

参照文献[6-7]和Sigma 公司活性测定方法，进行部分改进：取8只5 mL 离心管分别编号，其中7只各加入40µg/mL 胰蛋白酶200µL，依次加入0、20、40、80、120、160、200µL 重组蛋白纯化液；余下的1只离心管中加入20µL 1 mmol/L HCl 作为空白对照，用Tris-HCl 均补至2 mL，37℃水浴10 min，8只管各加入1 mL 1 mmol/L BAPNA，37℃水浴5 min，加入1 mL 60%醋酸终止反应。595 nm 处检测OD 值。根据下列公式计算Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的抑制率，绘制抑制曲线。

2 结果

2.1 Hespintor-Kazal 原核表达载体的构建

图1 Hespintor Kazal 结构域编码序列的PCR 产物Fig.1 PCR products of CDS of Hespintor Kazal domain.M:DL500 DNA marker;1–3:PCR products of Hespintor.

以pMD 20-T/Hespintor cDNA 克隆质粒为模板，利用PCR 方法扩增Hespintor Kazal 型结构域编码序列，产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测，在197 bp 处附近可见扩增产物(图1)，大小与预期相符。纯化后的PCR 产物与T 载体连接后经蓝白斑筛选和双酶切鉴定得到阳性重组子pMD 19-T Simple/Hespintor-Kazal，测序结果表明目的基因片段已正确插入至T 载体中。用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切T 载体得到的目的基因片段连接至经过同样酶切的pET-40b(+)，酶切鉴定结果表明重组原核表达载体 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 构建成功(图2)。

2.2 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白表达条件的筛选

pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 重组载体转化大肠杆菌Rosetta (DE3)，经诱导表达后进行15%SDS-PAGE 分析，在相对分子量约42 kDa 处出现明显的蛋白条带，与预期相符。表达条件的筛选结果表明，诱导时间对Hespintor-Kazal 重组融合蛋白表达量无明显影响，但诱导5 h 的表达量相对较多；IPTG 浓度对重组蛋白表达量亦无明显影响，由于高浓度IPTG 对细菌有毒副作用，因此选择0.25 mmol/L 作为IPTG 诱导浓度；诱导温度只有在33℃时重组蛋白表达量较少，考虑到温度对菌体生长的影响，故选择30℃作为诱导温度(图3)。诱导产物离心后获得的上清和沉淀经15% SDS-PAGE 分析，结果证实Hespintor-Kazal 重组融合蛋白以包涵体形式存在于沉淀中(图4)，约占菌体总蛋白量25.83%。进一步的Western blotting 检测表明，重组蛋白可与His 单克隆抗体发生特异性结合(图5)。

2.3 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的纯化复性与鉴定

将包涵体溶液进行组氨酸亲和层析，Hespintor-Kazal 重组融合蛋白经柱上复性后被洗脱，通过监控蛋白洗脱曲线，洗脱下来的目的蛋白出现明显的单一紫外吸收峰(图6A)。SDS-PAGE 结果显示经Ni2+柱纯化后的蛋白主要以两条条带迁移，尚有少量杂蛋白，故将亲和层析纯化产物再进行阴离子交换层析(图6B)，经SDS-PAGE 检测，最终得到目的蛋白的单一特异性条带(图7)。经Bradford 法测定，纯化蛋白浓度为193.678µg/mL，即每升诱导表达菌液经超声破碎与Ni2+柱及Q 柱两步纯化后可获得0.77 mg Hespintor-Kazal 重组融合蛋白。

图2 重组原核表达载体 pET-40b(+)/Hespintor-Kazal 的酶切鉴定Fig.2 Identification of pET-40b(+)/Hespinto-Kazal by enzyme digestion.M1:λ-Hind Ⅲ digest;1:pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;2–4:pET-40b(+)/Hespintor-Kazal digested with BamH Ⅰand Hind Ⅲ;5:PCR products of Hespintor-Kazal;6:pET-40b(+) digested with BamHⅠ and Hind Ⅲ;M2:DL2000 DNA marker.

图3 诱导温度对Hespintor-Kazal 重组融合蛋白表达量的影响Fig.3 Effect of induced temperature on the expression of Hespintor recombinant protein.1:Rosetta (DE3)induced;2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+) induced;M:PageRular prestained protein ladder;3:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced;4–7:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal induced with different temperature (24℃,27℃,30℃,33℃).

图4 诱导产物粗提取物的溶解性分析Fig.4 Solubility analysis of crude extracts from induced Rosetta(DE3).(A) M:PageRular prestained protein ladder;1:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;2:periplasm parts of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal;3:supernatant of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal.(B)1:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)induced;2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced;3:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal sloved in 8 mol/L urea;4:inclusion body of Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal.

图5 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的 Western blotting 鉴定Fig.5 Identification of purified Hespintor recombinant protein by Western blotting.M:PageRular prestained protein ladder; 1:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal non-induced; 2:Rosetta(DE3)/pET-40b(+) induced;3–5:Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor-Kazal induced with different IPTG concentration(0.25,0.50,0.75 mmol/L).

2.4 Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的活性鉴定

胰蛋白酶(Trypsin)可水解BAPNA 生成无色的苯甲酰-L-精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶色。若在此系统中加入过量的胰蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的水解活性，底物不能水解生成对硝基苯胺，溶液仍呈现无色。结果表明，随着蛋白浓度的上升，Hespintor-Kazal 重组融合蛋白对胰蛋白酶的抑制率也随之上升，当蛋白含量为38.74 mg/mL时，胰蛋白酶的抑制率达到91.57%。由此可见，Hespintor-Kazal 重组融合蛋白对胰蛋白酶具有较高的抑制作用，并且抑制曲线呈剂量依赖关系(图8)。

图6 Ni2+柱(A)和Q 柱(B)纯化Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的洗脱曲线Fig.6 Elution curve of Hespintor recombinant protein from Ni2+ column(A) and Q column(B).

图7 Ni2+柱及Q 柱纯化Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified Hespintor recombinant protein from Ni2+ column and Q column.M:PageRuler prestained protein ladder;1:purified Hespintor recombinant protein from Ni2+ column;2:purified Hespintor recombinant protein from Q column.

图8 纯化的Hespintor-Kazal 重组融合蛋白对胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory activity of purified Hespintor recombinant protein on trypsin.

3 讨论

已有研究表明，肿瘤细胞产生的蛋白酶降解ECM 及基膜的能力与其侵袭、转移能力密切相关。蛋白酶的活性可由多个层次进行调控[8-10]，但最直接的方法还是阻断蛋白酶活性。在此级联式反应中，uPA 发挥着关键性作用，被认为是肿瘤局部浸润和/或形成远处转移的限速步骤。尽管可在多个层次上调控蛋白酶活性，但最直接的方法还是阻断蛋白酶活性[9,11]。因此，干预uPA 水平或功能可成为治疗肿瘤的一种有效方法。

SERPIN (Serine proteinase inhibitor)是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，根据它们的序列特征和三维结构，目前归类为18个非同源蛋白质家族，其中以Kazal 型SERPIN 抑制uPA活性最为直接也最具有临床应用前景[12-14]。Kazal 型SERPIN 属于较为保守的家族之一，其成员多为小分子多肽，其中某些成员具有抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的活性，从而成为肿瘤治疗的新靶点[15-19]。蛋白质序列分析表明，Hespintor 具有与食管癌相关基因2(Esophageal cancer related gene 2，ECRG2)高度同源的serpin 基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等作用，因此提示Hespintor 可能具有同样的抗肿瘤能力[11,20-22]。

本研究将Hespintor 连接至原核表达载体pET-40b(+)中，采用IPTG 诱导Hespintor-Kazal融合标签蛋白的大量表达。pET-40b(+)原核表达载体具有两个显著特点：一是含有T7启动子，可被宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶识别，T7 RNA 聚合酶的转录效率比大肠杆菌RNA 聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，并大量表达融合蛋白；二是载体上携带Dsbc·Tag、His·Tag和S·Tag，诱导表达的35 kDa 标签蛋白对目的蛋白的结构及生物学活性影响很小，特别是分别位于目的蛋白前后的His·Tag 为进一步纯化蛋白提供了最佳亲和位点，而且两者之间有凝血酶(Thrombin)及肠激酶(Enterokinase)酶切位点，便于纯化后将标签蛋白切除[23–24]。诱导条件是影响外源蛋白表达的重要因素，诱导温度、诱导时间和IPTG 浓度是其中不可缺少的，由于三者之间有相互作用，应采用正交试验来进行优化。结果表明，诱导条件的变化对重组蛋白的表达量无太明显影响。本研究预实验发现，即使将IPTG 浓度降至0.1 mmol/L，进行16℃低温诱导，仍未有效增强重组蛋白的可溶性或提高其表达量。由于单因素实验结果差异甚微，因此仅采用最佳单因素条件进行重组蛋白的诱导表达。

在蛋白纯化复性过程中，首先采用Ni2+柱进行亲和层析，获得的洗脱曲线为单一峰；之后的SDS-PAGE 分析出现两条蛋白条带，重组蛋白为42 kDa 的蛋白条带，另一蛋白条带分子量约为50 kDa，在纯化前的电泳检测时并未出现。分析认为，该杂蛋白分子量与重组蛋白分子量不成倍数关系，并非重组蛋白的二聚体或多聚体，有可能是进行重组蛋白复性时重新折叠聚集的速度有时过快，导致某些蛋白碎片通过二硫键而随机聚集形成。SDS-PAGE 分析结果表明，Ni2+柱的上样流穿液中仍含有部分重组蛋白，说明Ni2+柱对重组蛋白His 标签的亲和力未达到饱和，或是重组蛋白本身结构限制了Ni2+柱对His 标签的亲和力[25-26]。根据上述分析，选择500 mmol/L 咪唑直接洗脱Ni2+柱而非梯度洗脱，以便于后继的蛋白纯化。由于预测重组蛋白的理论等电点pI 为7.12，所用缓冲液pH 8.0，故选择Q 柱进行阴离子交换层析，最终获得产物为单一条带的重组蛋白。

本文成功构建了Hespintor-Kazal 原核表达体系，并获得纯化的重组融合蛋白，之后初步证明其具有预期的生物学活性。下一步将重点围绕Hespintor-Kazal 重组融合蛋白的纯化复性工艺及其体内外抗肿瘤活性开展研究。

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